毛 鑫，阮俊杰，王 熠，操文浩，萬(wàn) 軍

西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 611756

半夏曲是由清半夏、白礬、六神曲、生姜汁、面粉等原料經(jīng)發(fā)酵等工藝制成。具有降逆止嘔，止咳化痰的功效，臨床用于惡心嘔吐，食欲不振，咳嗽痰壅［1］。現(xiàn)代研究顯示半夏曲中含琥珀酸、生物堿等多種活性成分［2］，但目前尚無(wú)半夏曲中含量指標(biāo)的控制方法。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)半夏曲的研究現(xiàn)狀以及琥珀酸、生物堿的化學(xué)性質(zhì)［3］，分別采用電位滴定法和紫外分光光度法分別對(duì)半夏曲中琥珀酸、總生物堿進(jìn)行測(cè)定，并開展方法學(xué)研究。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 試藥：半夏曲，四川弘升藥業(yè)有限公司2批，生產(chǎn)日期：2015年11月，2016年5月；內(nèi)江良輝藥業(yè)有限公司1批，生產(chǎn)日期：2016年3月；四川千方中藥股份有限公司1批，生產(chǎn)日期：2016年9月。依次編號(hào)為1～4號(hào)。方法學(xué)考察采用2號(hào)樣品。對(duì)照品：琥珀酸對(duì)照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：MUST-16030502)。鹽酸麻黃堿對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110821-201112)。

1.2 儀器 BS110S電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；HX-200型高速中藥粉碎機(jī)(浙江省永康市溪岸五金藥具廠)；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；DZ-2型自動(dòng)電位滴定儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 琥珀酸的測(cè)定［4-6］

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn) NaOH滴定液的配制 參照《中國(guó)藥典》2015版第三部［7］進(jìn)行配置標(biāo)定，所制NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度為0.101 9 mol/L。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)HCl滴定液的配制 參照《中國(guó)藥典》2015版第三部進(jìn)行配置標(biāo)定，所制HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確濃度為0.107 9 mol/L。

2.1.3 琥珀酸對(duì)照品溶液的配制 精密稱取18mg琥珀酸對(duì)照品，精密加入NaOH滴定液10 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30分鐘，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加新煮沸過(guò)的冷蒸餾水定容，搖勻，制成0.36 mg/mL的琥珀酸對(duì)照品溶液。

2.1.4 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約5 g，精密稱定，置錐形瓶中，加95%乙醇50 mL，加熱回流1小時(shí)，同上操作，再重復(fù)提取2次，放冷，濾過(guò)，合并濾液，蒸干，殘?jiān)芗尤霘溲趸c滴定液(0.1 mol/L)10 mL，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)30分鐘，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加新沸過(guò)的冷蒸餾水至刻度，搖勻，即得。

2.1.5 空白溶液的制備 乙醇150 mL置水浴鍋上蒸干，按“2.1.4”項(xiàng)方法中從“精密加入氫氧化鈉滴定液”開始配制空白溶液。

2.1.6 琥珀酸對(duì)照品溶液的電位突躍范圍測(cè)定 精密吸取濃度0.36 mg/mL的琥珀酸對(duì)照品溶液25 mL，置小燒杯中，將燒杯置電磁攪拌器的磁盤上，浸入電極，以濃度為0.094 32 mol/L的標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定，分階段記錄電位。記錄消耗酸溶液的體積和電位值，以電位的變化量(ΔE)和體積的變化量(ΔV)的比值為縱坐標(biāo)，電位變化前后所用HCl溶液體積的平均值(V)為橫坐標(biāo)作圖，繪制ΔE/ΔV～V電位曲線圖。見(jiàn)圖1。

2.1.7 供試品電位突躍范圍測(cè)定 精密量取25mL，照電位滴定法測(cè)定，用鹽酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白實(shí)驗(yàn)校正。滴定終點(diǎn)明顯，滴定曲線見(jiàn)圖2—3。

圖1 琥珀酸對(duì)照品滴定曲線

圖2 半夏曲樣品中琥珀酸滴定曲線

圖3 空白試驗(yàn)的滴定曲線

2.1.8 線性范圍的考察 精密稱取琥珀酸對(duì)照品30.0 mg，置50 mL容量瓶中，加 95%乙醇制成0.6 mg/mL琥珀酸對(duì)照品溶液。分別精密吸取3 mL、5 mL、7 mL、9 mL、11 mL、13 mL 的琥珀酸對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備。精密量取25 mL，照電位滴定法測(cè)定，以相應(yīng)的試劑同法制作空白，對(duì)滴定結(jié)果校正。以琥珀酸含量為橫坐標(biāo)，消耗的NaOH體積為縱坐標(biāo)。每1 mL氫氧化鈉滴定液(0.1 mol/L)相當(dāng)于5.904 mg的琥珀酸(C4H6O4)。結(jié)果顯示琥珀酸在1.8～7.8 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，琥珀酸回歸方程：Y=0.169 5X+0.005 2，r=0.999 2。

2.1.9 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一批次供試品溶液5份，按“2.1.7”項(xiàng)方法測(cè)定，空白校正。計(jì)算得RSD=1.71%，表明儀器精密度良好。

2.1.10 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別于 0、1、2、4、6、8 小時(shí)從同一供試品溶液中吸取25 mL并按法測(cè)定。計(jì)算得RSD=2.05%，表明供試品溶液在8小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.11 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 稱取同一批次半夏樣品粉末5份，每份約5 g，精密稱定，按“2.1.4”項(xiàng)方法提取，測(cè)定，用空白校正后，計(jì)算得樣品中平均含量為4.05 mg/g，且RSD=2.04%，表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.12 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份已知總酸含量的樣品2.5 g，取琥珀酸對(duì)照品10 g，精密稱定，按確定的方法提取，測(cè)定，并用空白進(jìn)行校正。計(jì)算回收率為100.19%，RSD=2.26%(n=6)。見(jiàn)表1。

表1 琥珀酸加樣回收實(shí)驗(yàn)

2.2 總生物堿的測(cè)定［8］

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品10.0 mg，置5 mL容量瓶中，加蒸餾水制成每l mL含0.2 mg鹽酸麻黃堿溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取半夏曲樣品粉末1.5 g，置50 mL三角瓶中，加濃氨水1 mL，濕潤(rùn)后，加三氯甲烷10 mL，稱定質(zhì)量。冷浸3小時(shí)后分別超聲提取60分鐘，加三氯甲烷補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過(guò)濾，殘?jiān)?0 mL三氯甲烷分3次洗滌，合并濾液與洗液，60℃以下加熱蒸發(fā)至三氯甲烷蒸干。加入8 mL三氯甲烷使溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL分液漏斗中，再依次精密加入10 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=5.6)和1 mL0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液，充分振搖后，靜置15分鐘，取三氯甲烷層，水層再用三氯甲烷同法萃取兩次，每次8 mL。合并三氯甲烷層，用三氯甲烷定容于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 精密稱取不含清半夏的樣品粉末1.5 g，置50 mL三角瓶中，按“2.2.2”項(xiàng)同法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 最大吸收波長(zhǎng)的確定 按供試品溶液的制備方法，不稱取半夏曲樣品粉末制備空白對(duì)照液。將對(duì)照品溶液、供試液、陰性對(duì)照液和空白對(duì)照液在280～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)光譜掃描。結(jié)果半夏曲樣品供試液和對(duì)照品溶液在416 nm處都有最大吸收，而空白對(duì)照液及陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾。故本含量測(cè)定最終確定416 nm波長(zhǎng)作為半夏曲鹽酸麻黃堿含量的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 的鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(C=0.208 0 mg/mL)至分液漏斗中，按供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，得各濃度的鹽酸麻黃堿溶液，以相應(yīng)的試劑同法制作空白。照紫外分光光度法，在416 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果回歸方程Y=18.58X+0.002，r=0.999 1。表明鹽酸麻黃堿在0.008 2～0.041 0 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，在416 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定5次。計(jì)算得RSD=2.28%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液，在416 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，并每隔30分鐘測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定7次。計(jì)算得RSD=2.84%，表明供試品溶液在180 min內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按“2.2.2”項(xiàng)同法平行制備5份供試品溶液，分別在416 nm處測(cè)定其吸收度。計(jì)算得樣品平均含量為0.181 mg/g，RSD=1.93%，表明該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取半夏曲樣品粉末0.7 g，5份，精密稱定，精密加入鹽酸麻黃堿對(duì)照品溶液(C＝0.208 0 mg/mL)0.8 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在416 nm處測(cè)定其吸收度。計(jì)算得平均回收率為99.71%，RSD為2.38%(n=6)。見(jiàn)表2。

表2 總生物堿的加樣回收實(shí)驗(yàn)

3 樣品測(cè)定

精密稱取不同批次供試品，按確定的方法分別進(jìn)行琥珀酸的含量測(cè)定和總生物堿的測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定2次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同半夏曲樣品含量測(cè)定

4 討論

4.1 指標(biāo)成分的選擇 半夏中的琥珀酸是其發(fā)揮止咳，祛痰，抗炎的主要成分。此外，半夏中所含的生物堿有降壓、降脂作用,對(duì)體外腫瘤細(xì)胞的增殖，也具有較強(qiáng)的抑制作用，抑瘤及鎮(zhèn)咳作用。因此，選擇琥珀酸和總生物堿作為其質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分。

4.2 半夏曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 現(xiàn)有半夏曲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要收載于中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)，但其中均無(wú)含量測(cè)定控制指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)半夏曲琥珀酸及總生物堿均進(jìn)行了含量測(cè)定，為更好控制半夏曲質(zhì)量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4.3 含量測(cè)定 在琥珀酸的測(cè)定中，滴定曲線有波動(dòng)現(xiàn)象，可能是由于自動(dòng)滴定速度過(guò)快，在儀器記錄數(shù)據(jù)的時(shí)間間隔內(nèi)，酸堿未反應(yīng)完全或者反應(yīng)完全后未攪拌均勻?？刂频味ㄋ俣群?，波動(dòng)現(xiàn)象消失?？偵飰A的測(cè)定采用的是酸性染料比色法，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)嚴(yán)格控制溶液的pH值，pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致生物堿無(wú)法與酸性染料結(jié)合成有色化合物，從而無(wú)法溶于有機(jī)化合物，影響測(cè)定結(jié)果。

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