房艷艷 ，李新民，路巖莉 ，韓耀巍 ，聶 坤，吳 超

1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

難治性癲癇是指頻繁的癲癇發(fā)作至少每月4次以上，應(yīng)用適當(dāng)?shù)囊痪€抗癲癇藥物(AEDs)正規(guī)治療，藥物穩(wěn)態(tài)血濃度在有效治療范圍內(nèi)，無(wú)嚴(yán)重的藥物副反應(yīng)；至少觀察2年，發(fā)作仍不能控制，影響日常生活；無(wú)進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或占位性病變［1］。電壓門控鈉通道基因突變與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)，涉及到編碼電壓門控性鈉通道亞型Na1.1的基因SCNIA突變最為重要。基因突變可改變鈉離子通道電生理功能，如電流-電壓曲線的移動(dòng)、電流幅度增加、失活減慢等，使得神經(jīng)元的興奮性增加，造成神經(jīng)元高頻高幅的異常放電波，進(jìn)而導(dǎo)致遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥、Dravet綜合征、顳葉癲癇等多種癲癇病理類型。本實(shí)驗(yàn)將以IE難治性癲癇耐藥機(jī)制形成為切入點(diǎn)，從電壓門控性鈉通道的基因表達(dá)入手，系統(tǒng)觀察熄風(fēng)膠囊對(duì)IE的治療效果，闡明其治療IE的可能作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量(45±10)g，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0004］。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 氯化鋰(100 g/瓶，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：115K1308)、阿托品(5 mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：H12020384)、鹽酸匹羅卡品(5 g/瓶，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：066k1730)、地西泮注射液(5 mg/mL，天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：0804032)、熄風(fēng)膠囊［院內(nèi)制劑，藥物組成：紫河車12 g，石菖蒲12 g，天麻8 g，僵蠶4 g，郁金8 g，全蝎4 g，姜半夏8 g。0.33 g/粒，天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院杏林藥廠，津藥制字(2001)Z第0252號(hào)］、卡馬西平(200 mg/片，北京諾華制藥公司，批號(hào)：H11022279)。

1.3 試劑及儀器 SCN1A抗體，牛血清-干燥血清，寧波新芝分子雜交爐，LF-III顯微鏡奧林巴斯 BX43，Image-Pro Plus(IPP6.0)軟件等；組織蛋白抽提試劑盒(CWbio.Co.Ltd Cat.No CW08911。2)SCN1A antibody(Biorbyt#orb13681)，SW-CJ-1D型超凈臺(tái)(江蘇通凈)，QL-902型渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，離心機(jī)(Eppendorf，Centrifuge 5415D)，酶標(biāo)儀(Thermo，MultiSkan3)，電泳槽(Cavoy，Mini P-4)、電泳儀(Bio-Rad)、半干轉(zhuǎn)槽(Bio-Rad)等；無(wú)RNA酶的EPpendorf管，液氮，-80℃冰箱，超純RNA提取試劑盒，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒，UltraSYBR Mixture，DNase I均購(gòu)自CWbio公司，熒光定量PCR儀(Bio-rad IQ5)。

1.4 方法

1.4.1 造模基本步驟 參照Honchar［2］和余倩［3］的方法：采用鋰-匹魯卡品注射方法，制備難治性癲癇大鼠模型。將150只大鼠隨機(jī)分成2組，正常對(duì)照組13只，其余137只用于模型的建立。氯化鋰按127 mg/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，18小時(shí)后硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射以減少外周膽堿能作用，30分鐘后匹羅卡品30 mg/kg(濃度1%，首次20 mg/kg，30分鐘后10 mg/kg)腹腔注射，大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)1小時(shí)后，再給予腹腔注射地西泮10mg/kg解除抽搐，如癇性發(fā)作不能緩解，可重復(fù)注射地西泮1～2次，直到癇性發(fā)作被解除。

1.4.2 模型評(píng)價(jià)驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法 驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法［4］：癇性發(fā)作達(dá)到Ⅳ級(jí)及以上，持續(xù)時(shí)間超過(guò)30分鐘，解除癇性發(fā)作后狀態(tài)良好的大鼠為合格的模型。本實(shí)驗(yàn)造模前大鼠共150只，其中24只出現(xiàn)0-Ⅲ級(jí)發(fā)作，表現(xiàn)為無(wú)反應(yīng)、耳面部抽搐、肌陣攣伴或不伴直立位等，為點(diǎn)燃不成功大鼠，予以剔除。造模后達(dá)到Ⅳ級(jí)及以上的大鼠共113只，在造模過(guò)程中由于癲癇頻繁發(fā)作死亡16只，在接下來(lái)的一周，大鼠的主要表現(xiàn)為精神萎靡、進(jìn)食活動(dòng)少、消瘦，暫不給予藥物及生理鹽水等灌胃處理，予葡萄糖鹽水及水果碎片飼養(yǎng)加強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)支持。期間6只大鼠相繼死去，對(duì)剩余存活且精神狀態(tài)良好的91只大鼠，每組13只分為7組，加空白組13只，共8組。

1.4.3 動(dòng)物分組及灌胃計(jì)量 將造模成功的91只大鼠隨機(jī)分為7組，分別為模型對(duì)照組(模型組)、熄風(fēng)膠囊低劑量組(熄低組)、熄風(fēng)膠囊中劑量組(熄中組)、熄風(fēng)膠囊高劑量組(熄高組)、卡馬西平治療組(CBZ組)、熄風(fēng)膠囊中劑量+卡馬西平組(熄卡組)、熄風(fēng)膠囊中劑量+1/2卡馬西平組(熄卡低組)，每組大鼠13只。造模前隨機(jī)選取13只大鼠，作為正常對(duì)照組(空白組)。其中熄低組：熄風(fēng)膠囊0.33 g，濃縮劑2 mL；熄中組：熄風(fēng)膠囊0.66 g，濃縮劑 2 mL；熄高組：熄風(fēng)膠囊 0.99 g，濃縮劑 2 mL；CBZ 治療組：CBZ 20 mg/kg；熄卡組：熄風(fēng)膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL和CBZ 20 mg/kg；熄卡低組：熄風(fēng)膠囊0.66 g，濃縮劑2 mL和CBZ 10mg/kg；空白組和模型組給予生理鹽水2 mL。每天上午灌胃1次，共持續(xù)60天。

1.4.4 標(biāo)本制備及檢測(cè)方法

1.4.4.1 免疫組化 各組隨機(jī)選取2只大鼠，迅速斷頭取腦，置于冰盤上4%戊二醛固定液中剝離腦組織，將含有雙側(cè)海馬的腦組織放入4%多聚甲醛緩沖液中固定，并標(biāo)記；免疫組化染色法染色：組織脫蠟、組織復(fù)水、組織抗原修復(fù)、去除組織內(nèi)的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉組織切片、血清封閉組織切片、二抗孵育、DAB顯色、組織脫水、透明；采用Image-Pro Plus(IPP6.0)軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算平均陽(yáng)性光密度。

1.4.4.2 Western-blot 各組隨機(jī)選取4只大鼠，迅速斷頭取腦，冰盤上迅速剝離出雙側(cè)海馬及皮層置于無(wú)RNA酶的EPpendorf管中，標(biāo)記后放入液氮罐之內(nèi)暫存，隨后保存于-80℃冰箱中，備用于RNA的提??；Western-blot：抽提蛋白后BCA法蛋白定量，對(duì)蛋白濃度調(diào)整，然后進(jìn)行目的蛋白、內(nèi)參蛋白WB實(shí)驗(yàn)；將光片采用 Bio-Rad2000型凝膠成像系統(tǒng)掃描后，應(yīng)用QUANTITYONE軟件進(jìn)行吸光度分析，測(cè)定灰度值，代表蛋白的表達(dá)量(Pgp/β-actin)。

1.4.4.3 Real-time RT-PCR 各組隨機(jī)選取4只大鼠，將大鼠迅速斷頭，剪開顱頂部皮膚，剝除顱骨，用高溫高壓消毒過(guò)的器械將鼠腦剜出，置于無(wú)菌冰盤，迅速剝離出雙側(cè)海馬及皮層置于無(wú)RNA酶的EP pendorf管中，標(biāo)記后放入液氮罐之內(nèi)暫

存。隨后保存于-80℃冰箱。采用超純RNA提取試劑盒提取總RNA：于樣品中加入1 mL上樣緩沖液，溶解后的RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，待溴酚藍(lán)遷移至凝膠長(zhǎng)度2/3時(shí)停止電泳，取出凝膠在紫外透射儀上觀察5、18和28 s條帶并攝影記錄。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，總反應(yīng)體系20 μL。反轉(zhuǎn)錄條件是：37℃孵育40分鐘，反應(yīng)結(jié)束后85℃保溫5分鐘。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。采用熒光定量PCR儀，用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用(±s)表示，多組比較采用one-way ANOVA分析，兩兩比較用q檢驗(yàn)；設(shè)置雙側(cè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化

2.1.1 空白組可見少量細(xì)胞表達(dá)SCN1A 神經(jīng)元細(xì)胞陽(yáng)性染色顯示胞體形狀多呈棱椎形。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色顯示胞體多為三角形、橢圓形或多邊不規(guī)則形。SCN1A免疫陽(yáng)性顆粒主要分布在細(xì)胞的胞膜和胞漿。模型組主要表現(xiàn)為大量神經(jīng)元細(xì)胞空泡樣變性、壞死，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加。治療組可以見到大量胞漿呈黃色、胞核較大的神經(jīng)細(xì)胞和胞漿呈黃色的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，和部分胞漿呈黃色、胞核較小、致密的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，呈陽(yáng)性表達(dá)。見圖1。

圖1 Ⅰ型鈉通道α亞基蛋白的表達(dá)情況(X200)

2.1.2熄風(fēng)膠囊對(duì)IE大鼠海馬SCN1A分布范圍的影響 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組SCN1A的表達(dá)水平上調(diào)(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組的SCN1A的表達(dá)水平均下調(diào)(P＜0.05)；與CBZ組相比，熄卡組SCN1A的表達(dá)水平低于CBZ組(P＜0.05)；中藥組各組之間均沒有顯著差異(P＞0.05)，見表1。

表1 熄風(fēng)膠囊對(duì)IE大鼠海馬SCN1A分布范圍的影響(±s)

表1 熄風(fēng)膠囊對(duì)IE大鼠海馬SCN1A分布范圍的影響(±s)

注：與空白組比較，◆表示P＜0.05；與模型組比較，■表示P＜0.05；與CBZ組比較，▲表示P＜0.05

?

2.2 Western-blot

2.2.1 BCA定量檢測(cè)結(jié)果 BCA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果及其標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表2，圖2。

2.2.2 SCNIA目的條帶及內(nèi)容條帶結(jié)果 樣品檢測(cè)上樣順序、蛋白濃度及條帶圖像，見圖3。

2.2.3 熄風(fēng)膠囊對(duì)IE大鼠海馬SCN1A表達(dá)程度的影響 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，模型組SCN1A的表達(dá)高于空白組(P＜0.05)；與模型組比較，各治療組SCN1A的表達(dá)均低于模型組(P＜0.05)；與CBZ組比較，熄卡低組SCN1A的表達(dá)低于CBZ組(P＜0.05)；中藥組各組之間均沒有顯著差異(P＞0.05)。見表3。

表2 BCA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果

圖2 BCA定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 SCN1A目的條帶及內(nèi)參條帶結(jié)果

表3 熄風(fēng)膠囊IE大鼠海馬SCN1A表達(dá)程度的影響(±s)

表3 熄風(fēng)膠囊IE大鼠海馬SCN1A表達(dá)程度的影響(±s)

注：與空白組比較，◆表示P＜0.05；與模型組比較，■表示P＜0.05；與CBZ組比較，表示P＞0.05

?

2.3 Real-time RT-PCR

2.3.1 各基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線 選取樣本cDNA進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2 μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60～95℃進(jìn)行融解曲線分析。從圖4可見，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均達(dá)到0.99，說(shuō)明線性相光度很高，而且擴(kuò)增效率均在90%以上，因此可以采用這種方法和上述引物對(duì)后續(xù)樣本進(jìn)行擴(kuò)增分析，見圖4。

圖4 SCN1A基因標(biāo)準(zhǔn)曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

2.3.2 熄風(fēng)膠囊對(duì)IE大鼠海馬SCN1AmRNA表達(dá)水平的影響 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，空白組為模型組的0.85倍，說(shuō)明模型組SCN1A mRNA的表達(dá)較空白組表達(dá)上調(diào)；CBZ組SCN1A mRNA的表達(dá)較模型組上調(diào)，為模型組的1.15倍；中藥組中熄高組、熄中組、熄低組SCN1A mRNA的表達(dá)較模型組下調(diào)，分別為模型組的0.86倍、0.82倍、0.93倍；聯(lián)合組中熄卡組SCN1A mRNA的表達(dá)較模型組下調(diào)，為模型組的0.88倍，熄卡低組SCN1A mRNA的表達(dá)較模型組上調(diào)，為模型組的1.16倍。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示熄高組、熄中組、熄低組、熄卡組對(duì)SCN1A mRNA表達(dá)有抑制作用，而卡馬組、熄卡低組對(duì)SCN1AmRNA表達(dá)有促進(jìn)作用。見表4。

3 討論

電壓門控性鈉通道是細(xì)胞動(dòng)作電位產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，鈉電流可引起細(xì)胞的去極化和傳導(dǎo)興奮，與神經(jīng)元持續(xù)反復(fù)性放電的發(fā)生有關(guān)。海馬的功能通過(guò)各種離子通道完成，其中鈉離子通道開放引起的去極化內(nèi)向電流是興奮性細(xì)胞產(chǎn)生動(dòng)作電位的關(guān)鍵［5-6］。電壓依賴性鈉通道在神經(jīng)元興奮中起的重要作用，決定神經(jīng)元放電的持續(xù)時(shí)間和頻率，其活性的改變是許多神經(jīng)元興奮性異常相關(guān)疾病(癲癇、缺血性腦損傷等)的病理基礎(chǔ)［7-8］。

VGSCsI型α亞基基因(SCN1A)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于胞體和樹突上，也表達(dá)于某些中間神經(jīng)元的軸突起始段［9］。位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)4帶，大小為81 kb，由26個(gè)外顯子編碼。在所有編碼NaV的基因中，編碼Na1.1的基因SCNIA與癲癇有關(guān)的基因突變的數(shù)量是最多的，同時(shí)SCN1A也被認(rèn)為是與癲癇的關(guān)系最為密切的一個(gè)。研究發(fā)現(xiàn)SCN1A的突變與癲癇的幾個(gè)表現(xiàn)型也是有因果關(guān)系的，例如遺傳性癲癇伴熱性驚厥附加癥(GEFS+)、Dravet綜

合征(DS)和顳葉癲癇(TLE)［10］。

Yu等［11］通過(guò)定向敲除小鼠SCN1A基因構(gòu)建了SMEI小鼠模型。結(jié)果顯示在純和Scn1a-/-小鼠海馬錐體細(xì)胞記錄到正常水平鈉電流，這可能與Nav1.1在此種神經(jīng)元中分布較少有關(guān)。與此相反，海馬GABA能抑制性中間神經(jīng)元(如雙極細(xì)胞)鈉電流顯著減少。此外，小腦GABA能浦肯野細(xì)胞也表現(xiàn)出峰電流、持續(xù)和復(fù)活鈉電流都顯著減少，這是小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重共濟(jì)失調(diào)的原因［12］。有學(xué)者通過(guò)將R1648H突變導(dǎo)入同源小鼠基因中構(gòu)建了GEFS+基因敲入小鼠模型。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)R1648H基因突變小鼠純合突變體(Scn1aRH/RH)具有自發(fā)的全面性發(fā)作，然而雜合突變體(Scn1aRH/+)自發(fā)性全面性發(fā)作、高溫誘導(dǎo)癲癇和三氟乙醚誘導(dǎo)癲癇發(fā)作閾值降低。在興奮性錐體細(xì)胞中僅表現(xiàn)出輕度加速那通道復(fù)活的作用，而在雙極神經(jīng)元中，鈉電流的幅值卻明顯降低。以上研究結(jié)果表明，Nav1.1在GABA能神經(jīng)元的表達(dá)高于興奮性神經(jīng)元(如錐體細(xì)胞)的表達(dá)。SCN1A基因突變選擇性影響高表達(dá)Nav1.1的GABA能神經(jīng)元，使其鈉電流密度減小、爆發(fā)高頻動(dòng)作電位的能力下降。而抑制性GABA能中間神經(jīng)元興奮性降低，會(huì)導(dǎo)致GABA能神經(jīng)元抑制作用減弱，從而引起大腦內(nèi)興奮和抑制作用失衡，引發(fā)癲癇。

馬融教授根據(jù)IE反復(fù)發(fā)作、病程纏綿、遷延不愈的特點(diǎn)，根據(jù)腎-精-髓-腦的密切關(guān)系，及“久病必虛”“久病必瘀”“久病入絡(luò)”的中醫(yī)理論，提出IE病機(jī)關(guān)鍵在于腎精虧虛，痰瘀阻絡(luò)，應(yīng)治以益腎填精、豁痰熄風(fēng)、化瘀通絡(luò)，并在此基礎(chǔ)上研制出中藥復(fù)方熄風(fēng)膠囊，標(biāo)本兼顧，扶正祛邪以進(jìn)行治療。在臨床研究上，馬融等［13］通過(guò)觀察提出熄風(fēng)膠囊是一種治療小兒癲癇強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作的有效中藥。路巖莉等［14］通過(guò)觀察癲癇患兒右熄風(fēng)膠囊治療后腦電圖癇樣放電頻率在清醒、慢波睡眠和快波睡眠階段較治療前明顯減少。表明熄風(fēng)膠囊在臨床上治療癲癇是有效的。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化、Western-blot、Real-Time PCR法檢測(cè)到IE大鼠海馬SCN1A在蛋白與mRNA兩個(gè)層面均表達(dá)上調(diào)。通過(guò)與正常大鼠比較，大鼠海馬SCN1A蛋白表達(dá)顯著增高；另外，IE大鼠海馬各個(gè)部位，均可見SCN1A蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞，包括CAI、CA3和齒狀回區(qū)。研究已經(jīng)證實(shí)海馬的錐體神經(jīng)元可以產(chǎn)生異常電活動(dòng)和動(dòng)作電位的簇發(fā)，進(jìn)而可以導(dǎo)致癲癇樣活動(dòng)的產(chǎn)生。第二，中藥復(fù)方熄風(fēng)膠囊單藥及聯(lián)合卡馬西平用藥干預(yù)后IE大鼠海馬SCN1A在蛋白與mRNA兩個(gè)層面均表達(dá)下調(diào)。提示中藥復(fù)方熄風(fēng)膠囊可能通過(guò)抑制IE大鼠鈉通道的基因表達(dá)而發(fā)揮治療作用。

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