馬 妍 ，郭利平 ，樊官偉 ，任 明 ，張 磊 ，王 怡 ，李 巖 ，孫 曉 ，趙宏杰 ，劉 丹

1天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬保康醫(yī)院，天津 300193；2天津中醫(yī)藥大學(xué)；3天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；4天津市武清區(qū)中醫(yī)醫(yī)院

缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IPC)是減輕缺血再灌注損傷的重要措施，缺血預(yù)適應(yīng)的保護(hù)效應(yīng)分為預(yù)適應(yīng)即刻產(chǎn)生且持續(xù)2～3小時(shí)的早期保護(hù)(early protection，EP)和在預(yù)適應(yīng)后12～24小時(shí)出現(xiàn)且持續(xù)24～72小時(shí)的延遲保護(hù)(delayed protection，DP)。研究表明，DP對(duì)心臟的保護(hù)作用包括改善心肌壞死、抗心律失常、保護(hù)血管內(nèi)皮、抗心肌頓抑、保護(hù)心肌舒張功能等［1］。相對(duì)于EP，DP效應(yīng)具有較長(zhǎng)的保護(hù)作用而更具有應(yīng)用價(jià)值。缺血預(yù)適應(yīng)是一種機(jī)械性操作，無(wú)法避免血管壁損傷、斑塊脫落等風(fēng)險(xiǎn)，因此根據(jù)IPC的機(jī)制，以藥物激發(fā)或模擬機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)物質(zhì)以減輕心肌損傷更具有臨床應(yīng)用價(jià)值。相對(duì)于西藥在某一環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，中藥可以通過(guò)多種途徑作用于損傷部位，其有效性更有保障。中藥的DP效應(yīng)已被研究證實(shí)［2］，但對(duì)其機(jī)制研究尚不充分。DP效應(yīng)的產(chǎn)生涉及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的激活，目前研究認(rèn)為包括“觸發(fā)物質(zhì)-中介物質(zhì)-效應(yīng)子”三個(gè)環(huán)節(jié)［3］。熱休克蛋白70是機(jī)體內(nèi)重要的應(yīng)激蛋白，在熱休克家族蛋白中表達(dá)量最高［4］，熱休克蛋白70是分子量在70KD左右的熱休克蛋白，是缺血預(yù)適應(yīng)DP效應(yīng)機(jī)制中重要的效應(yīng)子，其對(duì)心肌的保護(hù)作用可能通過(guò)抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、分子伴侶、保護(hù)內(nèi)皮功能、穩(wěn)定細(xì)胞骨架等方面實(shí)現(xiàn)［5］。本實(shí)驗(yàn)以缺氧復(fù)氧模擬缺血再灌注過(guò)程，研究芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用，以及其機(jī)制是否與上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)源性HSP70相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑 芪參益氣滴丸溶液由天津天士力集團(tuán)提供中藥浸膏，按一定比例于完全培養(yǎng)基中混合溶解而成。細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)(CCK-8)試劑盒(同仁化學(xué)研究所，日本，Lot.FH783)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(北京中生生物工程高技術(shù)公司，Lot.142715003)，丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所，Lot.20140117)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所，Lot.20140115)，大鼠 70kDa熱休克蛋白 1A(HSPA1A)檢測(cè)試劑盒(Cloud-Clone公司，美國(guó)，Lot.D600)，NAC(Sigma 公司，美國(guó)，Lot.YT305)，UNIQ-10 column Trizol總RNA抽提試劑盒(生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司，上海，Lot.50175111)，ImPromⅡReverse Transcription System逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司，美國(guó)，Lot.00322404)，F(xiàn)staStart Universal SYBR Green Master實(shí)時(shí)定量 PCR試劑盒(Roche公司，德國(guó)，Lot.154041020)。

1.2 儀器 恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，厭氧培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，倒置相差光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，新穎立式小容量恒溫?fù)u床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)，全自動(dòng)生化分析儀(日本日立 7020型)，多功能讀板機(jī)(瑞士Tecan公司)，核酸蛋白分析儀(美國(guó)Beckman)，PCR-C1000逆轉(zhuǎn)錄儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)。

1.3 心肌細(xì)胞原代 出生3天內(nèi)的Wistar乳鼠，消毒后取心臟，沖洗、剪碎、反復(fù)消化，收集上清液，離心，重懸細(xì)胞沉淀后接種至培養(yǎng)瓶，差速貼壁培養(yǎng)90分鐘，分離心肌細(xì)胞，加入0.1 mmol/L的5-brdu后，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱［6］。培養(yǎng)3天后，心肌傳代并以2.5×105個(gè)/mL的密度種入24孔板和6孔板，48小時(shí)后鏡下觀察可見(jiàn)純凈心肌細(xì)胞，成簇或單層，同步性搏動(dòng)，頻率為80～120次/min，細(xì)胞狀態(tài)良好，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)分為空白組(Control)、缺氧損傷組(H/R)、芪參益氣預(yù)適應(yīng)組(QS)、缺氧預(yù)適應(yīng)組(HPC)、缺氧預(yù)適應(yīng)+NAC組(HPC+NAC)、缺氧預(yù)適應(yīng)+NAC+芪參益氣預(yù)適應(yīng)組(HPC+NAC+QS)。

1.5 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 第一代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，換DMEM/F12同步24 h。同步后，各組實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下：Control組：將培養(yǎng)液置換成全培基(由90%DMEM/F12培養(yǎng)基，10%胎牛血清以及1%雙抗組成)，放入正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。H/R組：將培養(yǎng)液置換成全培基，培養(yǎng)28小時(shí)20分鐘后，放入94%N2-5%CO2-1%O2的缺氧培養(yǎng)箱中26小時(shí)(缺氧箱內(nèi)環(huán)境達(dá)到缺氧條件O2＜1%約需2小時(shí))，取出放入正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧2 h，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。QS組：換含芪參益氣0.5 mg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)1小時(shí)，余操作同H/R組。HPC組：將培養(yǎng)液置換成全培基后，放入缺氧培養(yǎng)箱中2小時(shí)40分鐘(缺氧箱內(nèi)環(huán)境達(dá)到缺氧條件O2＜1%約需2小時(shí))，再取出放入正常培養(yǎng)箱中復(fù)氧40分鐘，之后正常培養(yǎng)24小時(shí)，余操作同H/R組。HPC+NAC組：換含1 mmol/L的NAC溶液培養(yǎng)30分鐘，后同HPC組操作。HPC+NAC+QS組：換含芪參益氣0.5 mg/mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)30分鐘，后加入1 mmol/L的NAC繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，后同HPC組操作。注：芪參益氣滴丸溶液的作用濃度及作用時(shí)間均根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，為最佳作用濃度及作用時(shí)間。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.6.2 上清液LDH活性測(cè)定 留取96孔板每組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定上清液中LDH活性。

1.6.3 細(xì)胞活力測(cè)定 棄去96孔板細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入 100 μL體積比為1∶10的CCK-8與DMEM/F12的混合液，放入孵箱繼續(xù)孵育2 h，于波長(zhǎng)450 nm處，測(cè)定各孔吸光度(OD值)。

1.6.4 上清液MDA活性測(cè)定 留取24孔板培養(yǎng)細(xì)胞上清液，以硫代巴比妥酸法測(cè)定脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛(MDA)含量。

1.6.5 上清液SOD活性測(cè)定 留取24孔板培養(yǎng)細(xì)胞上清液，以WST-1法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活力。使用酶標(biāo)儀，測(cè)定波長(zhǎng)450 nm。

1.6.6 ELISA法測(cè)定心肌細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá) 取心肌細(xì)胞培養(yǎng)液測(cè)定各組HSP70的蛋白濃度。按照大鼠70 kDa熱休克蛋白1A(HSPA1A)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)，使用專業(yè)軟件curve expert 1.30計(jì)算出各組樣本實(shí)際蛋白濃度。

1.6.7 實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定心肌細(xì)胞HSP70 mRNA表達(dá) 按照試劑盒提取樣本心肌細(xì)胞的總RNA，檢測(cè)RNA的純度及濃度。以提取的總RNA為模板，根據(jù)試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)HSP70mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系：RT-PCR Mix12.5 μL，F(xiàn)-Prime0.5 μL，R-Primer0.5 μL，ddH2O11 μL，cDNA0.5 μL，總體積 25 μL。PCR反應(yīng)條件：50℃2分鐘→95℃10分鐘→95℃15秒，60℃1分鐘40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算出各樣本中HSP70 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 HSP70基因引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，定量資料以(±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在倒置相差光學(xué)顯微鏡下觀察，Control組心肌細(xì)胞呈網(wǎng)狀，緊密附著在培養(yǎng)皿底部，規(guī)律搏動(dòng)，狀態(tài)良好；H/R組心肌細(xì)胞大部分萎縮且附著不牢、停止搏動(dòng)；HPC+NAC組心肌細(xì)胞有少部分萎縮且附著不牢，大部分細(xì)胞保持網(wǎng)狀形態(tài)但停止搏動(dòng)；QS組、HPC組、HPC+NAC+QS組有少量心肌細(xì)胞停止搏動(dòng)，大部分細(xì)胞呈網(wǎng)狀且能夠緊密附著、規(guī)律搏動(dòng)，搏動(dòng)頻率略下降＜80/min。

2.2 心肌細(xì)胞損傷測(cè)定結(jié)果 與Control組相比，H/R組 CCK-8降低，LDH升高、MDA升高、SOD活力減少(P＜0.05)，說(shuō)明缺氧損傷模型組心肌細(xì)胞活性與抗氧化力減低、損傷嚴(yán)重，缺氧損傷模型成立；與H/R組相比，QS組與HPC組CCK-8、SOD升高(P＜0.01或 P＜0.05)，LDH、MDA 減少(P＜0.01或P＜0.05)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)中藥預(yù)適應(yīng)或缺氧預(yù)適應(yīng)的心肌細(xì)胞在經(jīng)過(guò)缺氧復(fù)氧損傷后仍表現(xiàn)出很好的細(xì)胞活性與抗氧化力，損傷輕；與HPC組比較，HPC+NAC組 CCK-8降低、LDH升高(P＜0.01)，MDA呈升高趨勢(shì)、SOD活力呈降低趨勢(shì)，說(shuō)明NAC抑制了缺氧預(yù)適應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的延遲保護(hù)作用，在經(jīng)過(guò)缺氧復(fù)氧損傷后細(xì)胞表現(xiàn)為活性降低、抗氧化能力減弱，損傷較重。HPC+NAC+QS組分別與HPC+NAC組、H/R組比較，CCK-8增高、LDH降低、MDA降低(P＜0.01或P＜0.05)，SOD活力呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)中藥與缺氧預(yù)適應(yīng)同時(shí)作用的心肌細(xì)胞在加入NAC后，細(xì)胞仍然可以表現(xiàn)出很好的活性與抗氧化能力，損傷輕。見(jiàn)表2。

2.3 心肌細(xì)胞中HSP70蛋白含量與mRNA表達(dá)測(cè)定結(jié)果 Control組與H/R組比較HSP70蛋白含量與mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與H/R組比較，經(jīng)過(guò)中藥或缺氧預(yù)適應(yīng)的心肌細(xì)胞HSP70蛋白含量與mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，蛋白含量 HPC較 QS組含量略高，HSP70 mRNA表達(dá)QS較HPC組表達(dá)略高。加入NAC后，缺氧預(yù)適應(yīng)的心肌細(xì)胞(HPC+NAC)HSP70蛋白含量及mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而中藥與缺氧預(yù)適應(yīng)同時(shí)作用的心肌細(xì)胞(HPC+NAC+QS)，HSP70蛋白含量沒(méi)有降低反而高于HPC組與QS組，mRNA表達(dá)也較HPC組略高，蛋白含量與mRNA均與HPC+NAC組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？傮w結(jié)果HSP70蛋白含量與mRNA測(cè)定基本一致。見(jiàn)表3。

表2 各組QSYQ預(yù)適應(yīng)對(duì)缺氧/復(fù)氧CM中CCK-8、LDH、MDA、SOD的影響(s)

表2 各組QSYQ預(yù)適應(yīng)對(duì)缺氧/復(fù)氧CM中CCK-8、LDH、MDA、SOD的影響(s)

注：與H/R組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；與HPC+NAC比較，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01

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表3 各組HSP70蛋白含量及mRNA表達(dá)

3 討論

中藥預(yù)適應(yīng)的DP效應(yīng)在很多研究中已經(jīng)被證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中芪參益氣滴丸對(duì)缺氧復(fù)氧損傷的心肌細(xì)胞發(fā)揮了延遲保護(hù)作用，其作用效果與缺氧預(yù)適應(yīng)基本一致［7］。HSP70可以主動(dòng)釋放到細(xì)胞外，在心肌缺血再灌注損傷的動(dòng)物模型和臨床心肌損傷的患者血清中均能檢測(cè)到高表達(dá)的HSP70［8-9］，HSP70 表達(dá)量與患者的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)［10］。以往研究表明，以不同方式誘導(dǎo)心肌缺血再灌注損傷模型中HSP70的表達(dá)可以發(fā)揮顯著的心肌保護(hù)作用。HSP70是缺血預(yù)適應(yīng)DP效應(yīng)作用機(jī)制中重要的“效應(yīng)子”，其主要通過(guò)抗氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用。HSP70能夠抑制促進(jìn)氧自由基生成的關(guān)鍵酶的活性(即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶)，通過(guò)反饋抑制調(diào)節(jié)減少氧自由基的生成；HSP70的抗氧化生物活性可以促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化劑的合成和釋放增加，HSP70與其結(jié)合物可以通過(guò)激活蛋白激酶C，增強(qiáng)蛋白酶活性，促進(jìn)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)水解，刺激生成超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，從而加快氧自由基的清除，研究發(fā)現(xiàn)SODmRNA水平的增高與HSP70mRNA表達(dá)的增高相一致［4］。在本實(shí)驗(yàn)中，芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)的心肌細(xì)胞中HSP70蛋白含量與mRNA表達(dá)均顯著提高，與缺氧預(yù)適應(yīng)結(jié)果一致，結(jié)合細(xì)胞損傷測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，可以說(shuō)明芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)通過(guò)上調(diào)HSP70的表達(dá)對(duì)缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞達(dá)到延遲保護(hù)作用。

為進(jìn)一步確定芪參益氣滴丸發(fā)揮保護(hù)作用的途徑，實(shí)驗(yàn)中加入特異性抑制劑NAC以阻斷“效應(yīng)子”環(huán)節(jié)HSP70的表達(dá)，結(jié)果一方面缺氧預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用被取消，同時(shí)HSP70的表達(dá)被抑制，而另一方面缺氧預(yù)適應(yīng)與芪參益氣預(yù)適應(yīng)共同作用的心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧損傷后依然保持活力，并且HSP70的表達(dá)顯著上調(diào)。這進(jìn)一步說(shuō)明芪參益氣滴丸預(yù)適應(yīng)不但能夠激發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)源性HSP70的釋放，而且可以推論其激發(fā)機(jī)制應(yīng)是多途徑的。通過(guò)多途徑啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)發(fā)揮治療作用是中醫(yī)藥的作用特點(diǎn)，很多實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)中藥對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是多因素、多途徑的調(diào)節(jié)過(guò)程［11］。正如張景岳云：“凡治病之道，攻邪在乎針?biāo)?，行藥在乎神氣。故施治于外，則神應(yīng)于中，使之升則升，使之降則降，是其神之可使也。若以藥劑治其內(nèi)而臟氣不應(yīng)，針艾治其外而經(jīng)氣不應(yīng)，此其神氣已去，而無(wú)可使矣”［12］。

芪參益氣滴丸是以現(xiàn)代科技提取黃芪、丹參、三七、降香中的有效成分精制而成的滴丸制劑，是中醫(yī)傳統(tǒng)理論和現(xiàn)代制劑技術(shù)結(jié)合的結(jié)晶［13］。研究證明，黃芪總皂苷可以通過(guò)上調(diào)HSP70表達(dá)發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的抗氧化保護(hù)作用［14］；丹參酮ⅡA預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷有顯著的延遲保護(hù)作用且與增加HSP70蛋白表達(dá)有關(guān)［15］；三七總皂苷長(zhǎng)時(shí)間處理可促進(jìn)HSP70的表達(dá)，對(duì)再灌注損傷心肌有良好的保護(hù)效應(yīng)［16］；降香總萜和降香總黃酮在冠心丹參處方對(duì)抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的作用中不可缺如［17］。芪參益氣滴丸最大限度的發(fā)揮了藥物對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，在對(duì)缺氧復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的保護(hù)方面具有與缺氧預(yù)適應(yīng)相當(dāng)?shù)淖饔茫渥饔脵C(jī)制與多途徑上調(diào)HSP70的表達(dá)有關(guān)。

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