劉不盡,鄒曉萍,張 濤,毛 偉,陳 政

(重慶市血液中心輸血研究所，重慶 400015)

藥物誘導(dǎo)免疫溶血性貧血(DIIHA)臨床發(fā)病急、進(jìn)展快，臨床表現(xiàn)不易與其他類型溶血性貧血鑒別，一旦延誤診治可致患者器官衰竭甚至死亡。但是，DIIHA若及時診斷，經(jīng)停藥和治療后可治愈，器官功能衰竭可逆。因此，早期發(fā)現(xiàn)并及時停藥是DIIHA的首要治療手段，可避免不良預(yù)后。DIIHA無特異性的臨床表現(xiàn)，對該病的診斷成為一大難題。如何提高對DIIHA的診斷能力，建立一條科學(xué)合理的DIIHA血清學(xué)檢查思路，幫助臨床及時診斷和正確治療是一個亟待解決的問題。

1 材料與方法

1.1材料 選取2015年1月至2017年4月本中心送檢血樣873份，其中抗人球蛋白試驗的患者血樣74份，交叉配血的患者血樣799份。樣本均為EDTA-K2抗凝。

1.2儀器與試劑 抗人球蛋白試劑抗IgG(上海血液生物，批號：20155101)；抗C3d(上海血液生物，批號：20155201)；抗IgG，C3d(上海血液生物，批號：20155102)；微柱凝膠卡(美國Biovue公司，批號：IGC635A，IGC664A)；紅細(xì)胞處理試劑盒(江陰力博醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，批號：201604005)；頭孢曲松(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號:015151042)；頭孢呋辛(深圳致君制藥有限公司，批號：K151107)；哌拉西林他唑巴坦(珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司，批號：60415002)；阿奇霉素(齊魯制藥有限公司，批號：502008CK)；青霉素(石藥集團(tuán)中諾藥業(yè)有限公司，批號:141108)；離心機(KA-2200，日本KUBOTA公司)；37 ℃水浴箱(S.HH.W21.600，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)；恒溫孵育箱及卡式離心機(Ortho，美國Biovue公司)。

1.3方法 分別采用試管抗人球蛋白法檢測紅細(xì)胞致敏情況，微柱凝膠間接抗人球蛋白法檢測血漿及放散液中藥物抗體。試驗均按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》及相關(guān)試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3.1直接抗人球蛋白試驗 采用試管抗人球蛋白法：取患者紅細(xì)胞以0.9%生理鹽水洗滌3次，配制成3%紅細(xì)胞懸液。試管中加抗人球蛋白試劑50 μL，再加入患者紅細(xì)胞懸液50 μL，離心觀察結(jié)果。

1.3.2藥物包被法檢測血漿中藥物抗體 將藥物配制成40 mg/mL濃度溶液，與正?；旌螼型紅細(xì)胞37 ℃孵育1 h后洗滌3次制成藥物包被紅細(xì)胞，配置成3%紅細(xì)胞懸液。5孔分別加入青霉素包被紅細(xì)胞懸液、頭孢曲松包被紅細(xì)胞懸液、頭孢呋辛包被紅細(xì)胞懸液、哌拉西林他唑巴坦包被紅細(xì)胞懸液、阿奇霉素包被紅細(xì)胞懸液各50 μL，第6孔加入未包被藥物的O型紅細(xì)胞作為陰性對照。每孔加入50 μL患者血漿，37 ℃孵育15 min，離心觀察結(jié)果。

1.3.3免疫復(fù)合物法檢測血漿中藥物抗體 藥物配制成1 mg/mL濃度溶液。微柱凝膠卡5孔分別加入青霉素溶液、頭孢曲松溶液、頭孢呋辛溶液、哌拉西林他唑巴坦溶液、阿奇霉素溶液各50 μL，第6孔加入50 μL PBS作為陰性對照。加入1滴3%正?；旌螼型紅細(xì)胞懸液。每孔加入50 μL患者血漿，50 μL 3%正?；旌螼型紅細(xì)胞懸液，37 ℃孵育15 min，離心觀察結(jié)果。

1.3.4放散液中藥物抗體檢測 血漿中檢出特異性藥物抗體的患者紅細(xì)胞以紅細(xì)胞處理試劑盒制備放散液，操作方法按照操作說明進(jìn)行，放散液按“1.3.2”及“1.3.3”血漿中藥物抗體檢測的方法分別以藥物包被法和免疫復(fù)合物法檢測抗體。

2 結(jié) 果

2.1直接抗人球蛋白試驗結(jié)果 總共873例患者中，直抗陽性患者156例。799例交叉配血患者標(biāo)本中，128例直抗陽性。其中抗IgG陽性85例，抗C3陽性8例，抗IgG+抗C3陽性35例。74例抗人球蛋白試驗患者標(biāo)本中，直抗陽性28例，其中抗IgG陽性15例，抗C3陽性5例，抗IgG+抗C3陽性8例。

2.2血漿中藥物抗體檢測結(jié)果

2.2.1藥物包被法 156例直抗陽性患者標(biāo)本中，117例與藥物包被紅細(xì)胞無凝集。29例與未包被藥物的O型紅細(xì)胞及藥物包被O型紅細(xì)胞均發(fā)生凝集，進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)其中12例患者血漿中存在同種抗體，17例患者血漿中存在自身抗體。 7例與所有藥物包被紅細(xì)胞均發(fā)生凝集，與未包被藥物的O型紅細(xì)胞不發(fā)生凝集，為非特異性藥物抗體。檢出特異性頭孢菌素抗體3例，凝集反應(yīng)，見表1。

2.2.2免疫復(fù)合物法 156例直抗陽性患者標(biāo)本中，123例患者血漿在加入藥物溶液的情況下與混合O型紅細(xì)胞行間接抗人球蛋白試驗無凝集。29例在未加入藥物溶液的情況下及加入藥物情況下與所有混合O型紅細(xì)胞均發(fā)生凝集。4例在加入頭孢曲松溶液的情況下與混合O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，患者1、2、3在加入頭孢呋辛溶液的情況下與混合O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集。凝集反應(yīng)，見表2。

2.3放散液中藥物抗體檢測 檢出特異性頭孢菌素抗體的4例患者，患者1、2、3紅細(xì)胞放散液與頭孢呋辛包被的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，與其他藥物包被紅細(xì)胞及未包被藥物的O型紅細(xì)胞無凝集，凝集反應(yīng)見表3；放散液以免疫復(fù)合物法檢測，4例在加入頭孢曲松溶液的情況下與混合O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，患者1、2、3在加入頭孢呋辛溶液的情況下與混合O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集。凝集反應(yīng)見表4。

2.4患者一般情況及用藥情況調(diào)查結(jié)果 患者一般情況及用藥情況，見表5。

表1 患者血漿與藥物包被紅細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

表2 患者血漿在加入藥物后與紅細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

表3 患者紅細(xì)胞放散液與藥物包被紅細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

表4 患者血漿在加入藥物后與紅細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果

表5 患者臨床情況調(diào)查

3 討 論

DIIHA的臨床表現(xiàn)多樣，多數(shù)患者出現(xiàn)發(fā)熱、疼痛、貧血、黃疸、血尿，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難、急性腎衰竭等。實驗室檢查有紅細(xì)胞計數(shù)下降，血紅蛋白降低，直接抗人球蛋白試驗陽性等表現(xiàn)。由于DIIHA沒有特征性的臨床表現(xiàn)，常常被臨床醫(yī)生誤診，引起不良預(yù)后。因此對該病的診斷成為一大難題，常常需要臨床醫(yī)師結(jié)合專業(yè)實驗室的血清學(xué)結(jié)果進(jìn)行識別。

該疾病可根據(jù)抗體檢測時是否依賴藥物分為藥物依賴性和非藥物依賴性DIIHA[1]。藥物依賴性抗體是造成DIIHA的最常見機制，最常見藥物為抗菌藥物[2-3]。藥物依賴性DIIHA間接抗人球蛋白試驗陰性，在加入藥物或用藥物包被紅細(xì)胞后進(jìn)行間接抗人球蛋白試驗結(jié)果轉(zhuǎn)為陽性。非藥物依賴性抗體所致DIIHA，間接抗人球蛋白試驗陽性，且抗體無特異性與所有試劑細(xì)胞反應(yīng)。而更多的分類方式是根據(jù)DIIHA的免疫機制不同[4]，分為以下4種類型：(1)自身抗體型，藥物改變了紅細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)構(gòu)，使自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗自身紅細(xì)胞的抗體。該種抗體在無藥物存在時也可以和紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，為非藥物依賴性DIIHA，這種抗體與自身免疫性溶血性貧血所產(chǎn)生的抗體不易區(qū)別,血清(或紅細(xì)胞放散液)與所有試劑紅細(xì)胞均有反應(yīng)。因反應(yīng)不需要藥物參與，在停藥后，溶血反應(yīng)不會立刻停止而是逐漸減弱[5]。(2)半抗原型，藥物作為半抗原進(jìn)入機體，與體內(nèi)蛋白結(jié)合成為全抗原誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IgG類抗體，抗體與吸附藥物的紅細(xì)胞作用造成紅細(xì)胞溶解而溶血。該抗體只有在藥物參與的情況下與紅細(xì)胞反應(yīng)，為藥物依賴性抗體。此類型溶血呈劑量依賴性，往往只有接受大劑量藥物的患者才出現(xiàn)溶血。(3)免疫復(fù)合物型，藥物在初次進(jìn)入機體時，刺激機體產(chǎn)生抗體，藥物再次進(jìn)入機體時，與藥物抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物附著于紅細(xì)胞上，激活補體發(fā)生血管內(nèi)溶血。(4)非免疫性蛋白吸附型，藥物與紅細(xì)胞膜結(jié)合后改變膜結(jié)構(gòu)，以非免疫的方式吸附清蛋白、IgA、IgG、IgM、α及β球蛋白于紅細(xì)胞上，引起DAT陽性。因為其機制并非由于抗體產(chǎn)生，較少出現(xiàn)溶血性貧血。

本實驗中，直抗陽性患者以抗IgG型居多，其次為抗IgG、C3型。檢出藥物抗體的4例中，抗IgG陽性2例，抗IgG，C3陽性2例，藥物抗體可通過Fc段被巨噬細(xì)胞識別而介導(dǎo)紅細(xì)胞在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞系統(tǒng)被破壞發(fā)生血管外溶血，也可通過激活補體系統(tǒng)導(dǎo)致血管內(nèi)溶血。

本實驗中，以藥物包被法檢測與藥物包被紅細(xì)胞無凝集，以免疫復(fù)合物法檢測在加入藥物溶液的情況下與混合O型紅細(xì)胞無凝集的患者可判斷血漿中不存在藥物抗體。但這些陰性病例中也可能存在假陰性結(jié)果。有專家指出，因部分藥物依賴性抗體只在藥物代謝產(chǎn)物存在時與紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，而在藥物本身存在時并不與紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，常導(dǎo)致誤診和假陰性結(jié)果[6]。檢測出自身抗體的患者中，也可能存在自身抗體型的藥物抗體。由于藥物改變了紅細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)構(gòu)，使自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗自身紅細(xì)胞的抗體。但這種抗體與自身免疫性溶血性貧血所產(chǎn)生的抗體不易區(qū)別。

在檢測血漿中藥物抗體時， 7例樣本與所有藥物包被紅細(xì)胞均發(fā)生非特異性凝集，與未包被藥物的O型紅細(xì)胞不發(fā)生凝集，這可能是由非免疫性蛋白吸附造成的。GARRATTY等[7]指出藥物改變了紅細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使紅細(xì)胞膜吸附蛋白質(zhì)，造成DAT陽性。SALAMA等[8]指出藥物造成的非免疫性蛋白吸附是由于藥物可以結(jié)合在紅細(xì)胞膜上，并且藥物上具有蛋白結(jié)合位點，以吸附血漿中的蛋白造成DAT陽性。

本實驗中檢出特異性頭孢抗體的4例患者通過臨床調(diào)查，有2例既往使用過頭孢菌素，有1例治療過程中使用過頭孢菌素，1例用藥史不詳。3例有明確頭孢菌素用藥史的患者產(chǎn)生了頭孢菌素抗體，但3例患者均無長期大量使用頭孢菌素的病史，所以藥物抗體的產(chǎn)生不僅與藥物量有關(guān)，更與機體的免疫功能相關(guān)。ARNDT等[9]指出第二代和第三代頭孢菌素是目前最常見的造成DIIHA的原因。4例與頭孢菌素發(fā)生特異性反應(yīng)的患者中， 3例藥物包被法檢測與頭孢呋辛包被紅細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，以免疫復(fù)合物法檢測與頭孢呋辛、頭孢曲松存在下的紅細(xì)胞均有反應(yīng)。另外1例僅以免疫復(fù)合物法檢測與在頭孢曲松存在下的紅細(xì)胞均有反應(yīng)。出現(xiàn)藥物包被法與免疫復(fù)合物法結(jié)果不一致的情況，可能是因為頭孢曲松鈉在體外無法吸附紅細(xì)胞導(dǎo)致無法以藥物包被法檢測頭孢曲松鈉抗體[10]。免疫復(fù)合物法檢測時3例患者出現(xiàn)頭孢呋辛、頭孢曲松存在下的紅細(xì)胞均有反應(yīng)，是由于頭孢菌素抗體存在交叉反應(yīng)。頭孢菌素與青霉素、半合成青霉素有共同的β-內(nèi)酰胺核心結(jié)構(gòu)，有的藥物抗體是針對這個共有的核心結(jié)構(gòu)，而有的藥物抗體則是針對側(cè)鏈[11]。頭孢曲松與頭孢呋辛不僅有相同的β-內(nèi)酰胺核心結(jié)構(gòu)，還有一部分側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)完全相同。患者的藥物抗體與頭孢曲松、頭孢呋辛均有反應(yīng)但與青霉素、哌拉西林他唑巴坦無反應(yīng)，可能與該藥物抗體針對了頭孢曲松、頭孢呋辛共有的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)而非β-內(nèi)酰胺核心結(jié)構(gòu)有關(guān)。由于不同的頭孢菌素抗體之間存在交叉反應(yīng)，常常建議出現(xiàn)過頭孢菌素抗體引起免疫溶血性貧血的患者不再使用任何頭孢菌素。本研究中未檢測到頭孢菌素抗體與青霉素、半合成青霉素發(fā)生交叉反應(yīng)，但有專家指出應(yīng)用頭孢菌素發(fā)生過DIIHA的患者在應(yīng)用其他頭孢菌或青霉素時應(yīng)慎重。

綜上所述，通過患者紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗、血漿中及紅細(xì)胞放散液中藥物抗體檢測，可以大大提高對DIIHA的診斷能力，鑒別溶血原因，并為臨床合理安全用藥提供依據(jù)。

[1]LEGER R M,ARNDT P A,GARRATTY G.How we investigate drug-induced immune hemolytic anemia[J].Immunohematology，2014，30(2):85-94.

[2]劉代紅.藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血[J].中國實用內(nèi)科雜志，2012，32(5)：338-339.

[3]GARRATTY G.Immune hemolytic anemia caused by drugs[J].Expert Opin Drug Saf，2012，11(4):635-642.

[4]GARRATTY G.Review:drug-induced immune hemolytic anemia-the last decade[J].Immunohematology，2004，20(3):138-146.

[5]劉達(dá)莊.免疫血液學(xué)[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，2002.

[6]BEATE M,THILO B,SALIH Y,et al.Variability of findings in drug-Induced immune haemolytic anaemia:experience over 20 years in a single centre[J].Transfus Med Hemother,2015,42(5):333-339.

[7]GARRATTY G,LEGER R.Red cell membrane proteins (CD55 and CD58) are modified following treatment of RBCs with cephalosporins[J].Blood,1995,86:68a.

[8]SALAMA A,MAYER B.Diagnostic pitfalls of drug-induced immune hemolytic anemia[J].Immunohematology,2014,30(2):80-84.

[9]ARNDT PA,LEGER RM,GARRATTY G.Serology of antibodies to second- and third-generation cephalosporins associated with immune hemolytic anemia and/or positive direct antiglobulin tests[J].Transfusion,1999,39:1239-1246.

[10]ARNDT PA,LEGER RM,GARRATTY G.Serologic characteristics of ceftriaxone antibodies in 25 patients with drug-induced immune hemolytic anemia[J].Transfusion,2012,52(3):602-612.

[11]楊啟修，朱自嚴(yán).藥物包被的紅細(xì)胞檢測血液中抗抗生素抗體[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2010,30(3):243-246.