黃愛(ài)軍，汪曾榮△，陳麗萍，馬樹(shù)強(qiáng)，陳瑞云，陸學(xué)東，林昆，黃醒中，陳庠侖（.中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院（深圳福田）骨科，廣東深圳58033；.深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東58049）

腱鞘炎是女性多發(fā)病，目前認(rèn)為，主要發(fā)病原因是腱鞘因機(jī)械性摩擦而引起的慢性無(wú)菌性炎癥改變，與長(zhǎng)期慢性勞損、先天性肌腱異常、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、內(nèi)分泌紊亂等有關(guān)[1?2]。但哺乳期或更年期婦女發(fā)病率高于其他女性，這2類(lèi)人群均伴雌激素水平的顯著變化，是否說(shuō)明雌激素在婦女腱鞘炎發(fā)病中可能起著重要的作用？雌激素通過(guò)與雌激素受體（ER）結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而ER基因具有多態(tài)性和變異性的特點(diǎn)，不同亞型的基因可能與不同的女性高發(fā)性疾病有關(guān)，如骨質(zhì)疏松、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[3]。目前，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)ER基因多態(tài)性與女性腱鞘炎關(guān)聯(lián)性的研究。因此，通過(guò)分析ER基因多態(tài)性與腱鞘炎的關(guān)系，進(jìn)一步深化對(duì)女性腱鞘炎發(fā)病機(jī)制的探討，具有重要的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2012年8月至2015年12月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院門(mén)診收治的絕經(jīng)期女性111例，均為絕經(jīng)1年以上。按患病情況分為A組（腱鞘炎患者）48例，年齡 46～71歲，平均（58.8±5.6）歲；平均絕經(jīng)年限（8.75±4.97）年。B組（絕經(jīng)期健康女性）63例，年齡52～72歲，平均（61.4±4.8）歲；平均絕經(jīng)年限（11.35±5.78）年。另選取63例非絕經(jīng)期健康女性（C組）作為健康對(duì)照組，年齡 22～47歲，平均（35.3±6.6）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）過(guò)早絕經(jīng)（≤40歲）；（2）有卵巢切除術(shù)史；（3）有ER相關(guān)疾病史，如卵巢癌、乳腺癌、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等；（4）有肝、腎及內(nèi)分泌疾病和自身免疫性疾病；（5）檢測(cè)期間服用激素或避孕藥，或選擇性ER調(diào)節(jié)劑。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA提取 采集所有研究對(duì)象早上8：00～9：00空腹?fàn)顟B(tài)下外周靜脈血4 mL置于乙二胺四乙酸抗凝試管中，分離白細(xì)胞并采用酚/氯仿法提取基因組DNA（美國(guó)Promega公司提供試劑盒），純化后?30℃低溫保存。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

1.2.2.1 檢測(cè)技術(shù) 采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）?限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)。

1.2.2.2 引物 參照文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，用于研究的ER?α基因XbaⅠ和PvuⅡ酶切位點(diǎn)多態(tài)性引物系列由上海英駿生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（Invitrogen）合成，上游：5′?CTGCCACCCTATCTTTTCCTATTCTCC?3′，下游：5′?TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATATCTGA?3′。PCR主要試劑由立陶宛Fermentas公司提供；DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)（PCR Markers?Ⅲ）由北京天為時(shí)代科技有限公司提供；XbaⅠ和PvuⅡ限制性?xún)?nèi)切酶為美國(guó)Promega公司提供；

1.2.2.3 凝膠電泳 采用1%西班牙瓊脂糖凝膠。

1.2.3 PCR反應(yīng) PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，其中基因組 DNA 0.1 μL，10 mmol/L Tris?HCl（pH=9.0），50 mmol/L KCl，1%Triton X?100，2.5 mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，0.25μmol/L的引物，300 ng模板DNA和2.0 U Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 變性 30 s，61 ℃ 退火 4 s，72 ℃ 延伸 90 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1.3 kb，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括ER基因的1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子。

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物限制性酶切及凝膠電泳分析 將PCR產(chǎn)物20μL分別用5 U XbaⅠ和PvuⅡ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切消化3 h，酶切產(chǎn)物在含0.5 mg/L溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中以110 V穩(wěn)壓電泳30 min，用紫外線(xiàn)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。在1.3 kb片段中檢測(cè)XbaⅠ和PvuⅡ的多態(tài)性部位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Pearson相關(guān)性分析；采用雙側(cè)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCR及酶切結(jié)果 根據(jù)XbaⅠ限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化將ER分為存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)和不存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)2類(lèi)；存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)者分為xx型和雜合子X(jué)x型，其中xx型位于910、390bp；Xx型位于1.3kb，910、390 bp；不存在XbaⅠ酶切位點(diǎn)者為XX型，位于1.3 kb；PvuⅡ限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化將ER分為存在PvuⅡ酶切位點(diǎn)和不存在PvuⅡ酶切位點(diǎn)2類(lèi)；存在PvuⅡ酶切位點(diǎn)者分為純合子pp型和雜合子Pp型，其中pp型位于 850、450 bp；Pp 型位于 1.3 kb，850、450 bp；不存在PvuⅡ酶切位點(diǎn)者為PP型，位于1.3 kb。見(jiàn)圖1。

趙忠堯太想給貧弱、落后的中國(guó)裝一臺(tái)加速器了！趙忠堯盤(pán)算著，如果最精密核心部件在美國(guó)秘密定制，然后再想方設(shè)法托運(yùn)回去，其他部件，他將技術(shù)參數(shù)默背下來(lái)，爛熟于心，然后回國(guó)自己制造，5萬(wàn)美元或許就夠了！

圖1 不同酶切電泳ER基因分型

2.2 三組研究對(duì)象ER基因分型及頻率比較 三組研究對(duì)象基因型分布均符合Hardy?Weinberg定律，具有群體代表性。A、B組研究對(duì)象中均無(wú)XX型者，C組研究對(duì)象中XX型3例（因例數(shù)太少，故未對(duì)此基因型進(jìn)行比較）。三組研究對(duì)象ER基因型分布中均以PP型出現(xiàn)的頻率最低，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1、2，圖2、3。

表1 A、B組研究對(duì)象ER基因分型及頻率比較

表2 A、C組研究對(duì)象ER基因分型及頻率比較

2.3 三組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性比較 A、B組研究對(duì)象均無(wú) XXPP、XXPp、XXpp、Xxpp型者，A、B 組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性中XxPP、xxPP、xxPp型出現(xiàn)頻率較低，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3、圖4。A、C 組研究對(duì)象均無(wú) XXPp、XXpp、Xxpp 型者，A組患者中XxPP、xxPP型各3例，而C組研究對(duì)象中無(wú)相應(yīng)基因型者，且C組研究對(duì)象中XXPP型3例，但A組患者中無(wú) XXPP型者，故未對(duì) XxPP、xxPP、XXPP型進(jìn)行比較；C組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性中xxPp型出現(xiàn)頻率較低，但與A組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4、圖5。

圖2 A、B組研究對(duì)象ER基因型分布比較

圖3 A、C組研究對(duì)象ER基因型分布比較

表3 A、B組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性比較

圖4 A、B組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性比較

表4 A、C組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性比較

圖5 A、C組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性比較

3 討 論

腱鞘炎是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，病情較輕者表現(xiàn)為患處疼痛，病情較重者伴患指活動(dòng)受限，使患者生活及工作均受到嚴(yán)重影響[5]。

目前認(rèn)為，主要是因腱鞘反復(fù)受機(jī)械性摩擦而引起的慢性無(wú)菌性炎癥。機(jī)械性摩擦刺激導(dǎo)致腱鞘發(fā)生充血、水腫、滲出等無(wú)菌性炎性反應(yīng)，反復(fù)發(fā)生的炎性反應(yīng)使纖維結(jié)締組織發(fā)生增生、肥厚、粘連等變化，從而導(dǎo)致“骨?纖維隧道”狹窄，進(jìn)而壓迫本已水腫的肌腱，使肌腱變性，從而使患指出現(xiàn)疼痛、活動(dòng)障礙等臨床表現(xiàn)。但腱鞘炎發(fā)病的真正病因尚未闡明，是由單因素引發(fā)，還是多因素共同作用的結(jié)果臨床醫(yī)生尚未達(dá)成共識(shí)。

腱鞘炎患者男女比例為10∶1，尤其是哺乳期或更年期女性發(fā)病率更高。很多學(xué)者通過(guò)長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，妊娠、哺乳和絕經(jīng)后女性腱鞘炎發(fā)病率明顯升高，提示性激素，特別是雌激素在腱鞘炎發(fā)病中可能具有重要作用[6?7]。

人ER由595個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為67×103。按受體所在部位分為核性ER（包括ERα和ERβ）[8]和膜性 ER（GPER1、Gap?ER、ER?X）[9?10]。人 ER基因位于6號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)4帶至6號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)7帶這一區(qū)間，包括8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子[11]。1號(hào)內(nèi)含子中有2處可以發(fā)生點(diǎn)突變，由于這2處點(diǎn)突變發(fā)生在限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ和PvuⅡ的識(shí)別位點(diǎn)上，因此，對(duì)ER基因的擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切便可以區(qū)分ER的不同基因型。不同的基因型有可能決定不同個(gè)體ER的表達(dá)水平和功能的差異，從而影響體內(nèi)雌激素的生物學(xué)作用[8]。

本研究橫向比較了絕經(jīng)期腱鞘炎患者與絕經(jīng)期健康女性及非絕經(jīng)期健康女性ER基因型及多態(tài)性分布情況，探討了ER基因型與絕經(jīng)后婦女腱鞘炎發(fā)病的關(guān)系。結(jié)果表明，A組患者ER基因型分布中Xx、xx、PP、Pp、pp 型分別占 43.750%、56.250%、12.500%、50.000%、37.500%，B組研究對(duì)象分別占 42.857%、57.143%、19.048%、47.619%、33.333%，C組研究對(duì)象分別占 42.857%、52.381%、4.762%、57.143%、38.095%，三組研究對(duì)象ER基因型分布中均以PP型出現(xiàn)的頻率最低，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所以，雖然PP型出現(xiàn)頻率較低，但尚不能認(rèn)為其是腱鞘炎的低患病基因（保護(hù)基因）。

本研究結(jié)果顯示，A組患者ER基因多態(tài)性中XxPP、XxPp、xxPP、xxPp、xxpp 型分別占 6.250%、37.500%、6.250%、12.500%、37.500%，B組研究對(duì)象分別占9.524%、33.333%、9.524%、14.286%、33.333%；C組研究對(duì)象 ER基因多態(tài)性中 XxPp、xxPp、xxpp型分別占42.857%、14.286%、38.095%；A、B組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性中XxPP、xxPP、xxPp型出現(xiàn)頻率較低，C組研究對(duì)象ER基因多態(tài)性中xxPp型出現(xiàn)頻率較低，但組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所以，雖然 XxPp、xxpp型出現(xiàn)頻率較高，尚不能認(rèn)為XxPp、xxpp型為絕經(jīng)后女性腱鞘炎的易感基因（患病基因）。

由于本研究只對(duì)核性ER進(jìn)行了分析，且研究對(duì)象樣本量相對(duì)較少，研究結(jié)果可能存在一定的偏倚。目前，對(duì)膜性ER的研究發(fā)現(xiàn)，膜性ER在女性相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展中同樣具有非常重要的作用[9，11]。對(duì)女性腱鞘炎在哺乳期及絕經(jīng)期高發(fā)的現(xiàn)象尚需進(jìn)行大樣本、多中心協(xié)作的更深入研究，才能為女性腱鞘炎的防治提供更有力的指導(dǎo)。

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