黃美媚，黎宏莊，歐陽基鵬，李國興，黎泳欣，甘育鴻

（1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬順德第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 佛山 528300；2.廣東醫(yī)學(xué)院 天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）已在全球造成3 500萬人患病，主要診斷依據(jù)為腦組織尸檢的中老年斑沉寂，以及包括神經(jīng)纖維纏結(jié)和腦組織在內(nèi)的萎縮程度[1]。在以淀粉樣蛋白級聯(lián)的假說中，β-淀粉樣蛋白（amyloid β-peptide，Aβ）是造成AD的關(guān)鍵因素[2]。進一步研究指出，一種蛋白質(zhì)被稱為Tau，其形成與AD的發(fā)展相關(guān)密切[3-4]。相關(guān)報道證實，他汀類藥物可能也具有治療AD的效果[5-6]，但其作用機制仍需研究。本研究采用人類神經(jīng)細胞株體外培養(yǎng)的實驗方式，觀察美伐他汀是否通過調(diào)控神經(jīng)細胞的方式，達到治療AD目的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人神經(jīng)上皮瘤細胞（SK-N-MC）（美國ATCC細胞庫），人類神經(jīng)細胞（MC65）（源自SK-N-MC細胞，廣東醫(yī)學(xué)院天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室制備），牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（美國Sigma Chemical公司），NaHCO3（上海瀚思化工有限公司），羊抗兔抗體（北京九州天瑞科技有限公司），羊抗、鼠抗體等購自美國Biotium公司，最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、青鏈霉素雙抗溶液、PBS購自北京中國國藥，美伐他?。绹鳶igma公司）。

1.2 主要試劑及儀器

薄層層析用硅膠（青島海洋公司），Western blot檢測儀TE22（Holliston，MA）、Thermo 310細胞培養(yǎng)箱購自上海樂陳化工科技公司，渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司），SDS-PAGE電泳槽（美國Thermo Fisher公司），全波長酵素免疫分析儀（美國Bio Pioneer Tech公司），低溫離心機（美國Beckman公司），熒光顯微鏡（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 神經(jīng)細胞培養(yǎng)選取SK-N-MC、MC65細胞株，用MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。用含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素雙抗體溶液細胞培養(yǎng)基（100μ/ml和100μg/ml）的培養(yǎng)皿置于37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長至90%，進行抽濾，使用無菌PBS沖洗，在培養(yǎng)皿中加入1 ml 0.05% Trypsin和0.02% EDTA，緩慢搖勻后，將培養(yǎng)皿置于37℃保溫箱中，反應(yīng)1min后將細胞自培養(yǎng)皿表面沖洗下來，1 000 r/min離心5min，取上清液。

1.3.2 MTT法將細胞平均分散至24孔盤中，當(dāng)細胞生長至50%時，加入0.5 ml/孔 MTT（0.5 mg/ml），將24孔盤置于37℃恒溫中30min等待MTT反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將MTT移除。加入0.5 ml二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO），均勻搖動3min，待細胞內(nèi)的紫色結(jié)晶溶解后，取至96孔盤，用分光光譜儀在波長550 nm處測定吸光值，比較細胞相對存活率。

1.3.3 免疫熒光染色加入BSA，于37℃輕搖30min，分別加入一抗、二抗抗體，各洗滌3次。En VisionTM兩步法流程參照文獻[7]。

1.3.4 Western blot檢測采用12% SDS-PAGE分離50μg總蛋白質(zhì)，常溫下采用醋酸纖維素膜封閉含有3% BSA 的 TTBS[100mmol/L Tris-HCl（pH=7.5），0.9%NaCl，0.1% Tween 20]。在洗滌1次后，分別2次加入相關(guān)抗體，孵育1 h。隨后洗滌3次，孵育30min。洗滌3次后，將色源底物孵育5min后顯色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 美伐他汀可以減緩Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細胞死亡

10μmol/L Aβ作用48 h后，SK-N-MC神經(jīng)細胞數(shù)降低；同時加入20μmol/L美伐他汀，SK-N-MC神經(jīng)細胞數(shù)降低情況改善，表明美伐他汀可以減緩Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細胞死亡（見圖1）。加入10μmol/L Aβ，SK-N-MC神經(jīng)細胞出現(xiàn)死亡，36 h后細胞活性下降至（20±6）%；同時加入美伐他汀，神經(jīng)細胞死亡情況改善，36 h后細胞活性下降至（60±15）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.6491，P=0.012）（見圖2）。

2.2 美伐他汀神經(jīng)保護作用與AMPK活化作用的關(guān)系

在對照樣品中加入10μmol/L Aβ時，AMPK無磷酸化現(xiàn)象。而加入美伐他汀或AMPK的促進劑阿卡地新24 h后，SK-N-MC神經(jīng)細胞AMPK有明顯的磷酸化。AMPK Thr172磷酸化與其活性程度呈正相關(guān)，結(jié)果顯示，美伐他汀可使AMPK進入活化狀態(tài)。美伐他汀可能通過提高AMPK活性，對抗Aβ毒性，發(fā)揮保護神經(jīng)的作用。見圖3。

圖1 美伐他汀減緩AD導(dǎo)致的神經(jīng)細胞死亡 （×50 000）

圖2 SK-N-MC神經(jīng)細胞死亡情況

圖3 美伐他汀誘發(fā)AMPK Thr172磷酸化

3 討論

Tau蛋白高度磷酸化是AD的主要病因，Tau蛋白磷酸化由AMPK等一系列激酶調(diào)節(jié)[3]。多個研究證實，激活A(yù)MPK可以抑制Tau蛋白磷酸化，相反抑制AMPK可以增加Tau蛋白磷酸化。研究表明，AMPK是Tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素[8-9]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入美伐他汀后，神經(jīng)細胞具有明顯活化AMPK的能力。此時AMPK的活性對于美伐他汀對抗AD的神經(jīng)保護效果是必須的。在給予美伐他汀后，AD所導(dǎo)致Tau蛋白過磷酸化現(xiàn)象被的抑制。另有研究顯示，AMPK和GSK-3β通過不同通路發(fā)揮作用，兩者可能存在協(xié)同效應(yīng)[10]。筆者推測，美伐他汀可能通過活化AMPK從而抑制Tau磷酸化，發(fā)揮保護神經(jīng)的作用。

有文獻顯示，Aβ在AD的發(fā)病機制中具有重要作用。因此Aβ對神經(jīng)細胞毒性的相關(guān)研究成為研究重點[11-13]?？刂艫β的生成和清除，從而形成動態(tài)平衡，對AD的預(yù)防起到重要作用[14]。有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物會造成AMPK活性上升，并進一步改變細胞內(nèi)能量平衡[15]。

在本實驗證明，美伐他汀可以減緩Aβ導(dǎo)致的神經(jīng)細胞死亡?？紤]Tau蛋白沉積，交互聚集成神經(jīng)原纖維纏結(jié)和有毒的可溶性蛋白片段是AD的主要病因。有研究進一步證實，AMPK通過改變Tau蛋白微管結(jié)合在Ser396和Ser262位點磷酸化Tau蛋白，并對其進行調(diào)控[16-17]。因此AMPK在Tau蛋白磷酸化中揮重要作用。由此筆者推論，美伐他汀可能通過提高AMPK活性，對抗Aβ毒性，發(fā)揮保護神經(jīng)的作用，抑制Tau蛋白磷酸化。

考慮通過抑制Aβ的異常聚集，能阻斷AD的發(fā)生、發(fā)展。因此，無論是從預(yù)防，還是治愈的角度考慮，綜合應(yīng)用他汀類藥物也是治療AD的有效方法。

參 考 文 獻 :

[1]ISHII-KATSUNO R, NAKAJIMA A, KATSUNO T, et al.Reduction of amyloid beta-peptide accumulation in Tg2576 transgenic mice by oral vaccination[J].Biochem Biophys Res Commun, 2010, 399(4):593-599.

[2]THINAKARAN G, KOO E H.Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function[J].J Biol Chem, 2008,283(44):29615-29619.

[3]RAFII M S.Targeting tau protein in Alzheimer's disease[J].Lancet,2016, 16:32107-32109.

[4]HE G, LUO W J, LI P, et al.Gamma-secretase activating protein is a therapeutic target for Alzheimer’s disease[J].Nature, 2010,467(7311):95-99.

[5]SALLUSTIO F, STUDER V.Targeting new pharmacological approaches for Alzheimer's disease:potential for statins and phosphodiesterase inhibitors[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2016, 15(6):647-659.

[6]朱天瑞, 李曉紅.他汀類藥物對阿爾茨海默病的治療作用[J].國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志, 2010, 37(1):77-79.

[7]THOMPSON C B.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease[J].Science, 1995, 267(5203):1456-1462.

[8]VINGTDEUX V, DAVIES P, DICKSON D W, et al.AMPK is abnormally activated in tangle- and pre-tangle-bearing neurons in Alzheimer’s disease and other tauopathies[J].Acta Neuropathol,2011, 121(3):337-349.

[9]陳濤, 周穎君, 王傳玲.AMPK在阿爾茨海默病中的作用機制[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2015, 33(6):621-626.

[10]ZHANG L, JOURET F, RINEHART J, et al.AMP-activated protein kinase (AMPK) activation and glycogen synthase kinase-3beta (GSK-3beta) inhibition induce Ca2+-independent deposition of tight junction components at the plasma membrane[J].J Biol Chem, 2011, 286(19):16879-16890.

[11]CHO J K, RYU Y B, CURTIS-LONG M J, et al.Inhibition and structural reliability of prenylated flavones from the stem bark of Morus lhou on β-secretase (BACE-1)[J].Bioorg Med Chem Lett,2011, 21(10):2945-2958.

[12]ZLOKOVIC B V, DEANE R, SAGARE A P, et al.Lowdensity lipoprotein receptor-related protein-1:a serial clearance homeostatic mechanism controlling Alzheimer’s amyloid β-peptide elimination from the brain[J].J Neurochem, 2010,115(5):1077-1089.

[13]NEMIROVSKY A, FISHER Y, BARON R, et al.Amyloid betaHSP60 peptide conjugate vaccine treats a mouse model of Alzheimer’s disease[J].Vaccine, 2011, 29(23):4043-4050.

[14]劉文娟, 戴雪伶, 姜招峰.β-淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性及其防治策略[J].生命科學(xué), 2011, 23(10):1022-1026.

[15]李小霞, 夏勇, 汪道文.辛伐他汀通過磷酸化作用增強內(nèi)皮一氧化氮合酶活性[J].中國分子心臟病學(xué)雜志, 2007, 7(5):253-259.

[16]MAIRET-COELLO G, COURCHET J, PIERAUT S, et al.The CAMKK2-AMPK kinase pathway mediates the synaptotoxic effects of Aβ oligomers through Tau phosphorylation[J].Neuron,2013, 78(1):94-108.

[17]THORNTON C, BRIGHT N J, SASTRE M, et al.AMP-activated protein kinase (AMPK) is a tau kinase, activated in response to amyloid beta-peptide exposure[J].Biochem J, 2011, 434(3):503-512.