高峰，張澤峰，王濤，王瑞

（河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 胸外一科，河北 石家莊 050011）

表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞具有對(duì)EGFR絡(luò)氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）高度敏感的反應(yīng)特性[1]。由于患者對(duì)EGFR TKIs具有極高的耐受性，以及其對(duì)無(wú)進(jìn)展生存期的顯著改善，一線應(yīng)用EGFR TKIs成為晚期NSCLC患者的標(biāo)準(zhǔn)化治療方案[2-3]，但是患者在接受9～13個(gè)月的EGFR TKIs治療后，開始出現(xiàn)獲得性TKIs耐藥[4-5]。持續(xù)用藥后難以回避的耐藥成為制約TKIs應(yīng)用的最大瓶頸[6]。根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤耐藥后，繼續(xù)應(yīng)用EGFR TKI單藥或者聯(lián)合其他治療方式依舊值得考慮[7]，為此，本文探究EGFR TKIs聯(lián)合化療的不同給藥方案對(duì)NSCLC細(xì)胞系促凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑

EGFR突變的NSCLC細(xì)胞系：PC9（19號(hào)外顯子突變）、H1975（L858R+T790M突變）、HCC827（19號(hào)外顯子突變）和HCC827GR（19號(hào)外顯子突變+cMET擴(kuò)增）由廣東肺癌研究所饋贈(zèng)。PC9ER（19號(hào)外顯子突變+T790M突變）由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院臨床藥理研究所饋贈(zèng)。

厄洛替尼、WZ4002、順鉑和紫杉醇購(gòu)自武漢永璨生物科技有限公司，溶于DMSO或水（順鉑），小劑量分裝存儲(chǔ)于-20℃冰箱。

1.2 MTS細(xì)胞毒性試驗(yàn)

各細(xì)胞系用含10%胎牛血清（四季青，浙江天杭生物科技有限公司）的DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司）在37℃、5%二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司Forma Steri-Cult型）中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入100μl/孔含1×104個(gè)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基鋪板，培養(yǎng) 72 h后，PC9、PC9ER、HCC827、HCC827GR 及H1975細(xì)胞分別加入順鉑（終濃度為0.01、0.10、1.00和10.00μmol/L）或紫杉醇（終濃度為0.001、0.010和0.100μmol/L），各處理組設(shè)置3～6個(gè)復(fù)孔。藥物處理72 h后，加入20μl/孔MTS復(fù)合物（美國(guó)Promega公司）繼續(xù)培養(yǎng)4 h后顯色。檢測(cè)前搖晃培養(yǎng)板10 s，混勻顏色。用酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-TeK公司Elx800型）于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果用Graph Pad Prism軟件進(jìn)行分析，使用非線性回歸模型對(duì)曲線進(jìn)行擬合。各藥物處理組相對(duì)空白對(duì)照組減少的細(xì)胞數(shù)用百分比表示。

1.3 集落形成試驗(yàn)

待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，取24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入500μl/孔含1×103個(gè)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基鋪板，不同藥物處理組設(shè)置≥2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。7 d后抽棄藥物，更換為完全培養(yǎng)基，使細(xì)胞培養(yǎng)增殖。當(dāng)細(xì)胞克隆生長(zhǎng)出現(xiàn)差異時(shí)，棄培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗2次，甲醇固定，0.005%結(jié)晶紫（德國(guó)默克公司）對(duì)細(xì)胞核染色后用倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司，IX83）拍照。顯微鏡下計(jì)數(shù)＜50個(gè)細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算集落形成率。集落形成率（%）=（集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4 Western bolt檢測(cè)

將細(xì)胞以2×105個(gè)/孔鋪于6孔板，1 ml/孔鋪于完全培養(yǎng)基。待其貼壁生長(zhǎng)1～2 d后進(jìn)行相應(yīng)藥物干預(yù)。用PBS緩沖液沖洗3次，使用細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解。使用Bio-Rad蛋白分析儀（美國(guó)Bio Rad公司，Hercules）在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組蛋白濃度。將各組蛋白用去離子水平衡后，加入3×蛋白分離緩沖液煮沸5min，-80℃存儲(chǔ)。

取5μl蛋白Marker，以及包含不加藥對(duì)照組在內(nèi)的6組各25μl樣品上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，然后電轉(zhuǎn)于PVDF膜。將膜封閉處理以防抗體非特異性結(jié)合，4℃一抗孵育過(guò)夜。次日，充分洗膜后，加入含辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的二抗，避光孵育1 h后洗膜，最后暗室曝光，晾干膠片后，掃描。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，采用Image J軟件對(duì)灰度值進(jìn)行分析。

抗體的使用：cPARP、ERK1/2和兔抗IgG HRP-抗體（英國(guó)Abcam公司）溶于5% BSA的TBST溶液中，稀釋倍數(shù)分別為1∶10 000、1∶3 000和1∶5 000。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR突變細(xì)胞系對(duì)不同濃度EGFR TKIs和化療藥物的耐受性

為建立藥物細(xì)胞毒性梯度，本實(shí)驗(yàn)首先采用順鉑或紫杉醇處理EGFR突變細(xì)胞系72 h，采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性變化。結(jié)果：①當(dāng)采用順鉑干預(yù)時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞活力為（1.36±5.92）%，而干預(yù)組為（-7.32±6.81）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.353，P=0.040）。濃度達(dá) 1μmol/L即可對(duì) PC9和PC9ER細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。對(duì)于其他細(xì)胞系，順鉑濃度＞3.3μmol/L才能檢測(cè)到細(xì)胞毒性（見圖1A）。②當(dāng)采用紫杉醇對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)時(shí)，3.3μmol/L濃度下能檢測(cè)到細(xì)胞毒性，且PC9對(duì)紫杉醇最為敏感（見圖1B）。③在集落形成試驗(yàn)中，筆者同樣對(duì)各細(xì)胞系進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的順鉑、紫杉醇和EGFR TKIs干預(yù)。順鉑在7 d的集落形成試驗(yàn)中對(duì)受測(cè)細(xì)胞系產(chǎn)生的細(xì)胞毒性與MTS法結(jié)果相似（見圖1C）。由于H1975對(duì)紫杉醇高度敏感，而無(wú)法判斷給藥順序差異對(duì)其產(chǎn)生的細(xì)胞毒性影響。耐藥細(xì)胞系（PC9ER、HCC827GR和H1975）對(duì)厄洛替尼高度耐受，但PC9ER對(duì)WZ4002卻極為敏感。

總之，對(duì)EGFR TKIs敏感和耐藥的PC9、HCC827細(xì)胞系在對(duì)化療藥物的敏感性上幾乎沒(méi)有差別，說(shuō)明TKI與化療藥物的敏感及耐藥機(jī)制并不相同（見圖1A、B）。為了后續(xù)試驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)選擇順鉑干預(yù)PC9和其他細(xì)胞系的濃度分別為1.0和3.3μmol/L；選取不僅能夠?qū)θ导?xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞全部死亡的紫杉醇濃度為3.3μmol/L。對(duì)于EGFR TKIs，筆者總結(jié)前人和自己的研究結(jié)果，選取能夠使敏感和耐受細(xì)胞系產(chǎn)生最大細(xì)胞毒性差異的厄洛替尼和WZ4002，濃度均為1μmol/L。

2.2 EGFR TKIs和化療不同給藥順序?qū)?xì)胞毒性的影響

為探究EGFR TKIs和化療不同給藥順序?qū)Ω鱁GFR突變細(xì)胞系的影響，本實(shí)驗(yàn)將藥物單用、聯(lián)用，以及順序給藥干預(yù)各細(xì)胞系7 d，并采用集落形成試驗(yàn)進(jìn)行分析。對(duì)照組細(xì)胞活力為（0.56±1.86）%，而干預(yù)組為（-7.06±5.91）%，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.013，P=0.013），HCC827GR、H1975細(xì)胞對(duì)順鉑和紫杉醇具有更高的敏感性，特別是在PC9或PC9ER細(xì)胞中，厄洛替尼或WZ4002與順鉑或紫杉醇聯(lián)用比單用能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。當(dāng)EGFR TKIs和化療藥物順序給藥時(shí)，在TKI干預(yù)前先給予化療比兩者順序顛倒能產(chǎn)生更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。實(shí)際上，在大多數(shù)情況下，先TKI后化療的給藥順序完全屏蔽了后者對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用。相似的結(jié)果也出現(xiàn)在那些對(duì)EGFR TKIs耐藥和特殊的突變抑制劑WZ4002干預(yù)的細(xì)胞系中。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者同樣檢測(cè)了聯(lián)合用藥時(shí)不同的組合時(shí)間（4 d或2+2 d）對(duì)PC9ER細(xì)胞系的影響，結(jié)果與6 d或3+3 d的干預(yù)時(shí)間并無(wú)區(qū)別。此外，因HCC827細(xì)胞系對(duì)厄洛替尼太過(guò)敏感，聯(lián)合用藥時(shí)因效果難以評(píng)估而將其從后續(xù)實(shí)驗(yàn)中剔除。見圖2。

2.3 化療藥物和厄洛替尼聯(lián)用對(duì)厄洛替尼耐藥模型凋亡的影響

在厄洛替尼耐藥細(xì)胞系中研究厄洛替尼和化療藥物同時(shí)或順序給藥（6 d或3+3 d）時(shí)，細(xì)胞裂解蛋白中的細(xì)胞凋亡標(biāo)志物cPARP的表達(dá)，以表示細(xì)胞凋亡反應(yīng)率的差異。厄洛替尼本身對(duì)PC9ER和HCC827GR的誘導(dǎo)凋亡作用極弱，但在H1975細(xì)胞系凋亡相對(duì)明顯。順鉑對(duì)PC9ER和H1975細(xì)胞都有一定的促凋亡作用，而紫杉醇只對(duì)后者有促凋亡作用。然而發(fā)現(xiàn)僅在HCC827GR細(xì)胞中，紫杉醇和厄洛替尼聯(lián)用較兩者前后順序使用細(xì)胞凋亡率升高。在某些情況下，兩藥同時(shí)干預(yù)甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡率下降。最顯著的凋亡反應(yīng)總是出現(xiàn)在先化療藥物處理，后厄洛替尼干預(yù)的細(xì)胞系中。只有采用先紫杉醇后厄洛替尼的給藥順序干預(yù)PC9ER細(xì)胞系和先順鉑后厄洛替尼的給藥順序干預(yù)HCC827GR細(xì)胞系在本質(zhì)上算唯一的誘導(dǎo)凋亡實(shí)驗(yàn)，而其他的給藥順序只有些許或者毫無(wú)促凋亡現(xiàn)象（見圖3）。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，筆者對(duì)PC9ER細(xì)胞系采用不同的藥物干預(yù)時(shí)間（4 d或2+2 d），發(fā)現(xiàn)與6 d和3+3 d的干預(yù)時(shí)間并無(wú)不同。ERK1/2作為內(nèi)參照來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)是否均勻加載。

圖1 EGFR突變的NSCLC細(xì)胞系的MTS細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 EGFR TKIs和化療藥物對(duì)各細(xì)胞系增殖的影響

圖3 各處理組細(xì)胞裂解蛋白的表達(dá)

3 討論

在EGFR突變的NSCLC患者中，對(duì)EGFR TKIs的獲得性耐藥是影響其療效發(fā)揮的主要限制因素[8-9]。雖然針對(duì)獲得性耐藥已提出一些治療策略[10-12]，但目前并無(wú)切實(shí)可行的公認(rèn)方案。腫瘤進(jìn)展后的化療、放療和TKI繼續(xù)服用，以及更新藥物的干預(yù)是目前的主要治療策略[13]，但有助于醫(yī)師在這些治療策略間進(jìn)行選擇的預(yù)測(cè)因素極為有限。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TKI聯(lián)合順鉑或紫杉醇具有協(xié)同作用。由于藥物狹窄的毒性窗和預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)4或6 d的藥物處理時(shí)間并無(wú)區(qū)別，本實(shí)驗(yàn)選擇了唯一的1種藥物濃度和為期6 d的藥物處理時(shí)間。有趣的是，對(duì)于TKI具有極高耐藥性的細(xì)胞系模型中，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到TKI能夠提高化療藥物的細(xì)胞毒性。此外，T790M二次突變和cMET擴(kuò)增作為TKI最常見的耐藥機(jī)制，其對(duì)藥物的反應(yīng)性無(wú)顯著差異。同樣本實(shí)驗(yàn)取得相似的結(jié)果，第1代TKI厄洛替尼與化療聯(lián)用的協(xié)同作用無(wú)論是對(duì)野生型還是突變型EGFR均具有親和力。筆者觀察到協(xié)同作用背后，第3代突變型EGFR特異性抑制藥物WZ4002對(duì)突變型EGFR的抑制作用極為顯著。在TKI聯(lián)合化療藥物的協(xié)同作用方面，本實(shí)驗(yàn)取得相似的結(jié)果。本研究結(jié)果表明，如果EGFR TKIs和化療相結(jié)合，藥物的給藥順序至關(guān)重要。如果先TKI干預(yù)，后化療處理，未出現(xiàn)協(xié)同作用，但是采取TKI和化療藥物同時(shí)或先化療藥物后TKI的給藥順序時(shí)，協(xié)同作用顯著。本研究的TKI耐藥模型與前人研究的TKI敏感NSCLC模型具有相似的結(jié)果，先化療后TKI治療優(yōu)于其他給藥方式[14]。臨床上，通常給予NSCLC患者周期性化療，同時(shí)聯(lián)用TKI很可能只在化療第1階段有協(xié)同作用[15]。根據(jù)本研究結(jié)果，針對(duì)獲得性EGFR TKIs耐藥，先化療后TKI可能是最為有效的給藥順序?？梢酝茰y(cè)，先化療后TKI的治療方式可以預(yù)先抑制獲得性耐藥的發(fā)展。已經(jīng)證實(shí)，患者可同時(shí)并發(fā)多種耐藥機(jī)制，而化療和TKI 2種治療方式的聯(lián)用可能阻止更多耐藥情況的發(fā)生。

總之，EGFR TKIs結(jié)合化療干預(yù)EGFR突變的NSCLC細(xì)胞系可以產(chǎn)生協(xié)同作用，且給藥順序極為關(guān)鍵。這種順序給藥策略值得臨床深入探究。

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