趙昌永

一、高效液相色譜的發(fā)展史

1.HPLC的前奏和萌芽

1903年，俄國植物學家茨維特（Tsweet）發(fā)表了“一種新型吸附現(xiàn)象及在生化分析上的應(yīng)用”的研究論文，文中第一次提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。稱之為色譜法。

馬?。∕atin） 和辛格（Synge）用一根裝滿硅膠微粒的色譜柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的有效分離，建立了液液分配色譜方法。

2.HPLC的建立和逐步完善

第一屆液相色譜會議1973年在瑞士的因特拉肯舉行，現(xiàn)在則稱之為HPLC73。哈恩和漢卡克以及他們的同事于1975年開創(chuàng)了生物高分子分離。

我國于70年代初，科學院大連化學物理研究所就開展了HPLC的研究，與工廠合作生產(chǎn)出了液相色譜固定相，并出版了論文集，編寫了高效液相色譜講義。

二、高效液相色譜分類、特點、原理、系統(tǒng)

1.高效液相色譜的分類及特點

高效液相色譜可依據(jù)溶質(zhì)（樣品）在固定相和流動相分離過程的物理化學原理分為五大類：

一是吸附色譜，二是分配色譜，三是離子色譜，四是體積排阻色譜，五是親和色譜。

高效液相色譜具有以下特點：

一是分離效能高。由于新型高效微粒固定相填料的使用，液相色譜填充柱的柱效達2×103～5×104/m理論塔板數(shù)。

二是選擇性高。由于液相色譜具有高柱效，并且流動相可以控制和改善分離過程的選擇性。因此，高效液相色譜不僅可以分析不同類型的有機物和同分異構(gòu)體，還可分析在性質(zhì)上極為相似的旋光異構(gòu)體。

2.高效液相色譜的原理及系統(tǒng)

高效液相色譜法是在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。高效液相色譜法是在高壓條件下溶質(zhì)在固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次交換的過程，它借溶質(zhì)在兩相間分配系數(shù)、親和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差別使不同溶質(zhì)得以分離[4]。

高效液相色譜的系統(tǒng)：

高效液相色譜儀的主要部件有：貯液罐、高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器等。其基本的工作流程是：貯液罐中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相中，被流動相載入色譜柱內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程后，各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。

三、高效液相色譜在各方面的應(yīng)用

高效液相色譜適于分析沸點高、分子量大、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)和生物活性物質(zhì)，它們約占全部有機化合物的80%?，F(xiàn)在高效液相色譜已在制藥業(yè)研究中、食品工業(yè)分析中、環(huán)境監(jiān)測、精細化工產(chǎn)品分析和生物化學及生物工程中獲得廣泛的應(yīng)用。

1.在藥業(yè)研究中的應(yīng)用

高效液相色譜在藥物分析中，主要考慮試樣的預(yù)處理和分析柱、檢測器的選擇，在試樣的預(yù)處理上，日前興起的固相（微）萃取使得許多含量低的成分得到精制提純，從而適于高效液相色譜[5]的測定。

青霉素有效成分的分離可采用反相鍵合相色法。色譜柱為Partisil-10 ODS，流動相：0.25摩爾每升碳酸銨水溶液，流量1.43毫升每分鐘。生物堿是從植物中提取獲得的含氮有機化合物，其種類繁多，大多數(shù)具有特殊的鎮(zhèn)痛生理作用，已在臨床上廣泛使用。

2.在食品工業(yè)分析中的應(yīng)用

黃曲霉素是貯存時由真菌產(chǎn)生的毒素，它們是一類稠環(huán)類固醇化合物，有致癌作用?；ㄉ械狞S曲霉素可用正相吸附色譜分析，分析前，樣品先用甲醇、氯仿、己烷、丙酮和乙酸乙酯等溶劑，經(jīng)機械震蕩30分鐘進行浸泡，經(jīng)濃縮、精制后進行分析。色譜柱為硅膠，流動相為氯仿和二氯甲烷，流量為0.5毫升每分鐘。使用熒光檢測器檢測，激發(fā)波長為365 nm，發(fā)射波長為408 nm[6]。

食品中糖含量是產(chǎn)品質(zhì)量控制的一個指標。糖類可以分為單糖、寡糖和多糖，它們可以用離子交換柱或氨基鍵合相柱進行分離。色譜柱為胺丙基硅膠柱，流動相為75%乙氰水溶液；流量為2.0 mL/min。用UVD（188 nm）進行檢測。

食品中的有機酸和酸味劑是食品酸味和鮮味的重要成分，也對食品的防腐起到重要作用。其中，咖啡酸及其衍生物可用反相鍵合相色譜進行分離。色譜柱為Li SI-C18 ，流動相為20%乙酸水溶液，流量為4.5 mL/min，用UVD檢測。

3.在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

高效液相色譜在環(huán)境監(jiān)測中已得到廣泛應(yīng)用。EPA列出11項酚類化合物。均是焦化、染料、造紙、化工等工業(yè)廢水的主要衍生物，污染范圍很廣，對環(huán)境危害極大。HPLC測定酚類化合物，可以保持酚類化合物組成不變，對各種不同取代基及不同結(jié)構(gòu)的酚類可以同時進行分離和分析，且具有重現(xiàn)性好、靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點。

4.在精細化工產(chǎn)品分析中的應(yīng)用

在精細化工生成中使用的具有較高分子量和較高沸點的有機物，如高碳數(shù)脂肪族或芳香族的醇、醚、醛和酮、酸等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物和染料等，都可以使用高效液相色譜進行分析。

使用凝膠滲透色譜柱分析聚乙二醇，色譜柱為AD-803/S，流動相為二甲基甲酰胺，流量1.0毫升每分鐘，柱前壓為1.0 Mpa，柱溫為62℃，用示差折光檢測器檢測。

5.在生物化學及生物工程中的應(yīng)用

當前隨著生命科學和生物工程技術(shù)的迅速發(fā)展，人們對氨基酸、多肽等生物分子的研究興趣日益增加。這些生物活化分子是人類生命延續(xù)過程必須攝取的成分，也是生物化學、生物工程中重要研究對象。

四、高效液相色譜的展望

高效液相色譜法是吸納了經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的優(yōu)點進行改進和發(fā)展起來的現(xiàn)代分析方法，具有分離速度快，測定效率高，重現(xiàn)性好的特點。目前指紋圖譜已成為國際公認的控制中藥或天然藥物質(zhì)量的最有效手段。國外也運用HPLC聯(lián)用技術(shù)在植物藥鑒別中。同時也是探索人類基因組DNA序列變異的新手段。可以預(yù)計，隨著研究工作的深入，高效液相色譜必將很快成為廣泛采用的新的色譜方法。