李宜奎等

摘要 ?{目的]克隆忽地笑{Lycorisaurea（LHér.）Herb.]α-葡萄糖苷酶2編碼基因。{方法]基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，分析功能注釋為α-葡萄糖苷酶2的基因片段，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性定量PCR擴(kuò)增引物分析其在各組織中的表達(dá)豐度，利用RACE（rapidamplificationofcDNAends）技術(shù)從高豐度組織中克隆獲得忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因。{結(jié)果]忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2cDNA全長(zhǎng)3185bp，開(kāi)放閱讀框?yàn)?961bp，編碼含有986個(gè)氨基酸殘基的LauAgl2蛋白質(zhì)。LauAgl2蛋白質(zhì)氨基酸序列具有α-葡萄糖苷酶Ⅱ特征性的保守結(jié)構(gòu)域和天冬氨酸殘基組成的活性中心，還具有一些蛋白質(zhì)糖基化的潛在位點(diǎn)（N-X-S/T共有序列）。LauAgl2蛋白質(zhì)與油棕、陸地棉等其他植物的α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列一致性為73.0%以上。利用pET表達(dá)系統(tǒng)，可以在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)LauAgl2蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)。{結(jié)論]成功從忽地笑花葶和花瓣中克隆到α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2并在大腸桿菌中對(duì)LauAgl2進(jìn)行了異源表達(dá)，為L(zhǎng)auAgl2蛋白質(zhì)的功能鑒定及其在忽地笑種子萌發(fā)與生長(zhǎng)發(fā)育中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ??忽地笑;α-葡萄糖苷酶2;分子克隆;原核表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)S??188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）36-0078-05

α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20）在植物種子萌發(fā)過(guò)程中具有重要的生理作用。α-葡萄糖苷酶參與植物種子萌發(fā)過(guò)程中淀粉的水解，產(chǎn)生為胚芽生長(zhǎng)提供能量的物質(zhì){1]。在這過(guò)程中，α-葡萄糖苷酶作用于淀粉水解產(chǎn)生的麥芽糖及麥芽寡糖，生成游離的葡萄糖{2-3]。植物α-葡萄糖苷酶活性的降低會(huì)影響種子萌發(fā)過(guò)程中淀粉代謝，導(dǎo)致麥芽糖積累，阻止種子萌發(fā){4]。擬南芥α-葡萄糖苷酶的缺失影響了細(xì)胞內(nèi)纖維素合成酶機(jī)器中的部分N-糖蛋白的功能性糖基化修飾，使得細(xì)胞壁中主要結(jié)構(gòu)組分——纖維素嚴(yán)重下降，從而導(dǎo)致早期胚胎徑向膨脹，影響擬南芥早期胚胎的形態(tài)發(fā)生{5]。因此，克隆α-葡萄糖苷酶編碼基因并進(jìn)行深入研究對(duì)闡明其在植物種子萌發(fā)過(guò)程中的生理作用及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

忽地笑{Lycorisaurea（LHér.）Herb.]是石蒜科石蒜屬多年生草本球根藥用植物，富含加蘭他敏、石蒜堿等石蒜科植物所特有的一類(lèi)生物堿{6]。加蘭他敏是唯一在臨床上得到應(yīng)用的石蒜科生物堿，作為一種長(zhǎng)效的、選擇性的、可逆的、競(jìng)爭(zhēng)性的乙酰膽堿酯酶抑制劑{7]，其在臨床上用于治療老年癡呆癥{8]。忽地笑不僅通過(guò)鱗莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，而且可以通過(guò)種子進(jìn)行有性生殖，是加蘭他敏工業(yè)生產(chǎn)的良好原料{9]。基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù){10]，筆者從中篩選出α-葡萄糖苷酶候選基因片段，利用RACE方法克隆到了忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和原核表達(dá)分析等研究，為理解α-葡萄糖苷酶2在忽地笑種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)與發(fā)育過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料該研究所用忽地笑植株采自江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所藥用植物種質(zhì)資源圃（庫(kù)）。大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）分別用于基因克隆和原核表達(dá)，為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存;原核表達(dá)載體pET28a購(gòu)自Novagen公司;pMD19-T、T4DNAligase、PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）反轉(zhuǎn)錄試劑盒和限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit購(gòu)自Clontech公司;

1.2RNA的提取稱(chēng)取忽地笑組織約0.1g，于液氮中充分研磨，具體參照錢(qián)彬彬等{11]的方法提取RNA以及檢測(cè)RNA的純度與完整性。

1.3組織中基因豐度分析

稱(chēng)取花期忽地笑的根、花柱、花葶、花苞、子房、花瓣和雄蕊及盛葉期忽地笑的葉片，液氮速凍后提取忽地笑不同組織的RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶獲得忽地笑不同組織的cDNA;利用忽地笑內(nèi)參基因TIP41{12]和α-葡萄糖苷酶候選基因CL6740的特異性引物（表1），以各組織cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。PCR程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min;95℃變性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算忽地笑不同組織中α-葡萄糖苷酶候選基因的豐度。

1.4全長(zhǎng)cDNA的克隆

基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù){10]，選擇功能注釋為α-葡萄糖苷酶2的基因片段，設(shè)計(jì)該片段的克隆引物以及5′端和3′端的RACE（rapidamplificationofcDNAends）引物（表1）。RACE擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min;95℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸120s，共30個(gè)循環(huán);72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并用膠回收試劑盒回收;回收片段連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞;菌落PCR驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性克隆子測(cè)序。

根據(jù)片段間的重疊區(qū)域拼接基因序列，獲得全長(zhǎng)cDNA序列;利用在線(xiàn)軟件ORFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框（openreadingframe，ORF），根據(jù)ORF序列設(shè)計(jì)引物L(fēng)auAgl2-ORF-PF和LauAgl2-ORF-PR（表1）擴(kuò)增LauAgl2的編碼區(qū)。目標(biāo)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)切膠回收，連接克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞;經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證后，挑取陽(yáng)性克隆子測(cè)序，保存測(cè)序正確的重組菌株并提取質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pMD-LauAgl2。

1.5生物信息學(xué)分析

利用在線(xiàn)程序BLASTp（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)分析氨基酸序列;利用BioEdit軟件{13]和ClustalW程序分別進(jìn)行氨基酸序列的聯(lián)立與比對(duì)分析;利用PROSITE（http：∥prosite.expasy.org）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)LauAgl蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);利用Protter（http：∥wlab.ethz.ch/protter/start/）分析氨基酸序列的信號(hào)肽及糖基化位點(diǎn){14]。

1.6LauAgl2的原核表達(dá)及SDS-PAGE電泳檢測(cè)

質(zhì)粒pET28a利用限制性?xún)?nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切;利用引物對(duì)pET28a-LauAgl2-PF和pET28a-LauAgl2-PR（表1）擴(kuò)增獲得LauAgl2的編碼序列（LauAgl2）;利用OneStepCloningKit將LauAgl2組裝到pET28a質(zhì)粒的NdeⅠ與XhoⅠ位點(diǎn)之間，獲得pET28a-LauAgl2，經(jīng)測(cè)序正確后提取質(zhì)粒并連同空載體pET28a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆子進(jìn)行原核表達(dá)分析。

將構(gòu)建的重組菌株接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，然后按1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接入50mLLB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min培養(yǎng)至A600達(dá)0.6～0.8，吸取菌液1mL，并加入終濃度0.1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)24h;菌液于12000r/min離心5min，棄上清液，加入200μL無(wú)菌水重懸菌體，加入50μL5×SDS上樣緩沖液，沸水浴10min，室溫下12000r/min離心10min;取20μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析。

2結(jié)果與分析

2.1α-葡萄糖苷酶2候選基因在忽地笑不同組織中的豐度

基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù){10]，根據(jù)注釋為α-葡萄糖苷酶2的基因片段CL6740序列設(shè)計(jì)特異性定量PCR擴(kuò)增引物，以忽地笑TIP41基因?yàn)閮?nèi)參基因{12]，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法分析α-葡萄糖苷酶候選基因在忽地笑不同組織中的豐度（圖1）。CL6740基因片段在忽地笑的鱗莖、根、葉、花柱、花葶、花苞、子房、花瓣和雄蕊中均有表達(dá)，且在花葶和花瓣中的豐度較高，在雄蕊中的豐度次之，其余組織中的豐度相對(duì)較低。這說(shuō)明CL6740基因片段在忽地笑中的表達(dá)具有一定的組織特異性。

2.2忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因的克隆

以忽地笑花葶和花瓣組織的cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得了CL6740片段及其5′端和3′端，通過(guò)拼接測(cè)序結(jié)果，得到1條長(zhǎng)度為3185bp的全長(zhǎng)cDNA序列，包含一個(gè)2961bp的開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)包含986個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（圖2）。進(jìn)一步通過(guò)BLASTp分析發(fā)現(xiàn)，編碼的蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶31家族，含有α-葡萄糖苷酶Ⅱ特征性的保守結(jié)構(gòu)域（圖3A），而且具有α-葡萄糖苷酶的保守基序（圖3B），所以將該基因命名為L(zhǎng)auAgl2。

2.3LauAgl2蛋白質(zhì)氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

通過(guò)分析LauAgl2基因編碼的氨基酸序列，結(jié)果表明LauAgl2蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量109916Da，理論等電點(diǎn)pI5.19;LauAgl2蛋白質(zhì)氨基酸序列中具有一些蛋白質(zhì)糖基化的潛在位點(diǎn)——N-X-S/T共有序列，說(shuō)明LauAgl2蛋白可能在翻譯后水平上需要糖基化修飾，可能是以糖蛋白的形式執(zhí)行功能。

分析預(yù)測(cè)的LauAgl2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)中含有大量的無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊以及少量的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角;具體上，LauAgl2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含47.67%的無(wú)規(guī)則卷曲、25.56%的β-折疊、18.66%的α-螺旋和8.11%的β-轉(zhuǎn)角。

2.4LauAgl2氨基酸序列的同源性

通過(guò)與其他植物α-葡萄糖苷酶2進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)，結(jié)果顯示，LauAgl2與鳳梨{Ananascomosus（Linn.）Merr.]、油棕（ElaeisguineensisJacq.）、陸地棉（GossypiumhirsutumLinn.）、博落回{Macleayacordata（Willd.）R.Br.]等植物的α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列一致性達(dá)73.0%～80.7%;LauAgl2的氨基酸序列與上述植物α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列具有很多保守區(qū)域，均具有α-葡萄糖苷酶Ⅱ的特征模序，包括有天冬氨酸組成的活性中心（DGIWNDMNE）（圖4），表明植物的α-葡萄糖苷酶2具有較高的保守性。

2.5LauAgl2的原核表達(dá)分析

在大腸桿菌BL21（DE3）中，通過(guò)將LauAgl2的編碼序列組裝到pET28a表達(dá)系統(tǒng)，并在N-端融合組氨酸標(biāo)簽序列，利用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在含重組質(zhì)粒pET28a-LauAgl2的細(xì)胞中檢測(cè)到1條相對(duì)分子質(zhì)量約為110kDa的蛋白質(zhì)條帶（圖5），與預(yù)測(cè)的6hisLauAgl2蛋白質(zhì)的理論相對(duì)分子質(zhì)量基本一致，這說(shuō)明目標(biāo)蛋白質(zhì)6hisLauAgl2在大腸桿菌中成功表達(dá)。而且，隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，6hisLauAgl2蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著增加。

3討論

該研究在分析忽地笑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)考察忽地笑不同組織中α-葡萄糖苷酶2候選基因片段CL6740的豐度，進(jìn)一步利用RACE方法從忽地笑花葶和花瓣中克隆得到一個(gè)α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2。LauAgl2基因cDNA全長(zhǎng)3185bp，存在一個(gè)2961bp長(zhǎng)度的開(kāi)放閱讀框，編碼1個(gè)含有986個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)LauAgl2。LauAgl2蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶31家族（GH31），其氨基酸序列的N-端不具有分泌信號(hào)肽序列。LauAgl2蛋白質(zhì)與其他植物來(lái)源的α-葡萄糖苷酶2氨基酸序列具有較高的一致性，且具有相似的保守結(jié)構(gòu)域和相同的活性位點(diǎn)，說(shuō)明該蛋白在進(jìn)化上是高度保守的。

α-葡萄糖苷酶不僅能夠催化麥芽糖等物質(zhì)末端非還原性的α-1，4連接的葡萄糖苷鍵的水解，釋放D-葡萄糖，還能夠?qū)牡途厶穷?lèi)底物非還原末端釋放的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一糖類(lèi)、酯類(lèi)或蛋白質(zhì)類(lèi)底物上，形成α-1，6葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖苷、糖酯、糖肽等物質(zhì){15-17]，在低聚異麥芽糖及一些非天然的α-葡萄糖苷等生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。該研究克隆到忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2為其功能基礎(chǔ)研究及應(yīng)用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

{1]TAGAMIT，YAMASHITAK，OKUYAMAM，etal.Molecularbasisfortherecognitionoflong-chainsubstratesbyplantαglucosidases{J].JBiolChem，2013，288（26）：19296-19303.

{2]STANLEYD，REJZEKM，NAESTEDH，etal.Theroleofα-glucosidaseingerminatingbarleygrains{J].PlantPhysiol，2011，155（2）：932-943.

{3]SUNZT，HENSONCA.Aquantitativeassessmentoftheimportanceofbarleyseedαamylase，βamylase，debranchingenzyme，andαglucosidaseinstarchdegradation{J].ArchBiochemBiophys，1991，284（2）：298-305.

{4]KONISHIY，OKAMOTOA，TAKAHASHIJ，etal.EffectsofBaym1099，anα-glucosidaseinhibitor，onstarchmetabolismingerminatingwheatseeds{J].BiosciBiotechnolBiochem，1994，58（1）：135-139.

{5]GILLMORCS，POINDEXTERP，LORIEAUJ，etal.α-glucosidaseIisrequiredforcellulosebiosynthesisandmorphogenesisinArabidopsis{J].JCellBiol，2002，156（6）：1003-1013.

{6]GUOY，PIGNINB，ZHENGYH，etal.AnalysisofbioactiveAmaryllidaceaealkaloidprofilesinLycorisspeciesbyGCMS{J].NatProdCommun，2014，9（8）：1081-1086.

{7]NOVIKOVAIY，TULAGANOVAA.Physicochemicalmethodsfortheanalysisofgalanthamine（Review）{J].Pharmaceuticalchemistryjournal，2002，36（11）：623-627.

{8]馬廣恩.加蘭他敏治療老年性癡呆癥的研究概況{J].藥學(xué)進(jìn)展，1998，22（3）：153-156.

{9]谷海燕，謝孔平，李世麗，等.石蒜屬植物的無(wú)性繁殖研究{J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2012（2）：32-35.

{10]WANGR，XUS，JIANGYM，etal.DenovosequenceassemblyandcharacterizationofLycorisaureatranscriptomeusingGSFLXtitaniumplatformof454pyrosequencing{J].PLoSOne，2013，8（4）：1-10.

{11]錢(qián)彬彬，李宜奎，李潔，等.忽地笑CYP98A的分子克隆與表達(dá)分析{J].分子植物育種，2018，16（11）：3533-3541.

{12]MAR，XUS，ZHAOY，etal.Selectionandvalidationofappropriatereferencegenesforquantitativereal-timePCRanalysisofgeneexpressioninLycorisaurea{J].FrontPlantSci，2016，7：536.

{13]HALLTA.BioEdit：AuserfriendlybiologicalsequencealignmenteditorandanalysisprogramforWindows95/98/NT{J].NucleicAcidsSympSer，1999，41（2）：95-98.

{14]OMASITSU，AHRENSCH，MULLERS，etal.Protter：Interactiveproteinfeaturevisualizationandintegrationwithexperimentalproteomicdata{J].Bioinformatics，2014，30（6）：884-886.

{15]MALSˇ，DVORˇKOVH，HRABALR，etal.Towardsregioselectivesynthesisofoligosaccharidesbyuseofα-glucosidaseswithdifferentsubstratespecificity{J].CarbohydrRes，1999，322（3/4）：209-218.

{16]OKUYAMAM，SABURIW，MORIH，etal.α-glucosidasesandα-1，4-glucanlyases：Structures，functions，andphysiologicalactions{J].CellMolLifeSci，2016，73（14）：2727-2751.

{17]SUGIMOTOM，F(xiàn)URUIS，SASAKIK，etal.Transglucosylationactivitiesofmultipleformsofα-glucosidasefromspinach{J].BiosciBiotechnolBiochem，2003，67（5）：1160-1163.