朱晨　田采云　張舒婷

摘要[目的]優(yōu)化茶樹種質(zhì)資源SSR-PCR反應(yīng)體系。[方法]以福建省不同地區(qū)的53份茶樹種質(zhì)資源作為SSR-PCR體系優(yōu)化的供試材料，通過(guò)L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)茶樹SSR-PCR反應(yīng)體系的3個(gè)影響因素：DNA模板濃度（ng/μL）、引物濃度（mmol/L）和Taq酶濃度（U）在4個(gè)水平上進(jìn)行比較篩選，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。[結(jié)果]優(yōu)化后最佳的福建省茶樹SSR-PCR反應(yīng)體系為25 μL體系，其中 DNA模板濃度50 ng/μL、引物濃度0.25 mmol/L、Taq酶濃度1.25 U。并從23對(duì)茶樹SSR引物中篩選出5對(duì)清晰、明亮、無(wú)雜帶的引物，適用于福建省茶樹SSR標(biāo)記的進(jìn)一步研究。[結(jié)論]該研究可為后續(xù)福建省茶樹品種的親緣關(guān)系分析、雜交品種的選育等研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞茶樹；種植資源；SSR-PCR；體系優(yōu)化；正交設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)S571.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）28-0088-04

Optimization of SSRPCR Reaction System for 53 Tea （Camellia sinensis） Germplasm Resources in Fujian Province

ZHU Chen1，2， TIAN Caiyun1， ZHANG Shuting1，3 et al

（1.College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002；2.Key Laboratory of Tea Science in Fujian Province， Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002；3.Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou，F(xiàn)ujian 350002）

Abstract[Objective]To optimize the SSRPCR reaction system for tea germplasm resources.[Method]Fiftythree tea plant germplasm resources in different regions of Fujian Province were used as the optimized materials for the SSRPCR system. Through the L16（43） orthogonal design， three factors affecting the SSRPCR reaction system of tea plant， DNA template concentration （ng/μL）， primer concentration （mmol/L） and Taq enzyme concentration （U） were screened at four levels， and PCR verification was performed. [Result]The optimum SSRPCR reaction system for tea in Fujian Province was 25 μL system， in which the concentration of DNA template was 50 ng/mL， primer concentration was 0.25 mmol/L， Taq enzyme concentration was 1.25 U. From 23 pairs of SSR primers， 5 pairs of primers with clear， bright and nostray bands were selected， which is suitable for further study on SSR markers of tea plants in Fujian Province. [Conclusion]This study provides a basis for the analysis of the genetic relationship and hybrid breeding of tea cultivars in Fujian Province.

Key wordsCamellia sinensis；Germplasm resource；SSRPCR；System optimization；Orthogonal design

茶樹（Camellia sinensis）屬于山茶科山茶屬，是多年生、木本、常綠植物，福建省是茶葉的主產(chǎn)地之一，該省茶樹栽培歷史悠久，種質(zhì)資源豐富[1]。近年來(lái)隨著新品種選育研究和示范推廣工作的不斷深入，越來(lái)越多的優(yōu)良茶樹新品種對(duì)茶區(qū)產(chǎn)量和品質(zhì)提升起到了推動(dòng)作用[2]。但優(yōu)質(zhì)茶樹種質(zhì)資源應(yīng)用并不容易，因此，應(yīng)進(jìn)一步發(fā)掘、鑒定、篩選和推廣具有眾多優(yōu)良遺傳性狀的種質(zhì)資源[3]。傳統(tǒng)的育種方法選育周期長(zhǎng)，親本選擇范圍有限，種質(zhì)資源的識(shí)別、鑒定困難等問(wèn)題，限制了茶樹種質(zhì)資源研究工作的進(jìn)一步深入。

SSR（simple sequence repeat）標(biāo)記是以串聯(lián)重復(fù)DNA序列PCR擴(kuò)增為核心的新型DNA分子技術(shù)[4]。SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有基因組覆蓋率、多態(tài)性高，多等位基因特性顯著，遺傳信息量大等優(yōu)點(diǎn)，在分子標(biāo)記領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可[5]，并已運(yùn)用到眾多作物領(lǐng)域[6-8]。

已有報(bào)道顯示，由于不同茶樹品種的SSRs重復(fù)基元和重復(fù)次數(shù)都存在變異，同時(shí)SSRs兩側(cè)序列保守性高[9]，可以在SSRs的側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)特異引物[10]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)茶樹種質(zhì)資源進(jìn)行識(shí)別、鑒定、研究和分析[11]。SSR技術(shù)作為一種理想可靠的分子標(biāo)記技術(shù)可以運(yùn)用于茶樹遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[12]、茶樹親緣關(guān)系[13]、茶樹遺傳多樣性[14]、茶樹種質(zhì)資源鑒定和新品種選育等研究中[15]。

福建省茶樹SSR技術(shù)研究起步較晚，適用于福建省茶樹SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)信息有限，國(guó)內(nèi)外有關(guān)福建省茶樹SSR-PCR體系優(yōu)化的報(bào)道較少，這在極大程度上制約了福建茶樹遺傳分析、種質(zhì)資源鑒定等研究的深入[16]。因此，建立適合福建省茶樹的SSR-PCR擴(kuò)增體系至關(guān)重要。筆者以課題組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為依托，開發(fā)適用于福建省茶樹SSR的相關(guān)引物，并利用L16（43）正交試驗(yàn)對(duì)福建省茶樹SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化篩選，旨在建立穩(wěn)定高效的福建省茶樹SSR-PCR反應(yīng)體系，為后續(xù)SSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于福建省茶樹親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性分析，揭示當(dāng)前福建省茶樹種質(zhì)資源的現(xiàn)狀提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

53份供試材料采自福建省7個(gè)地區(qū)（表1），采后將茶樹葉片置于密封袋中，經(jīng)液氮處理后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.2方法

1.2.1茶葉DNA提取。

茶樹基因組DNA提取參照王磊等[17]的改良CTAB法，用2%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度。

1.2.2SSR引物篩選。

根據(jù)茶樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)運(yùn)用Primer 3程序，選取23對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，退火（溫度根據(jù)不同引物而定）1 min，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。選擇擴(kuò)增條帶單一、清晰明亮、無(wú)嚴(yán)重拖帶的引物進(jìn)行后續(xù)SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究。

1.2.3

SSR-PCR反應(yīng)體系篩選。

采用L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)茶樹SSR-PCR反應(yīng)體系的3個(gè)影響因素：DNA模板濃度（ng/μL）、引物濃度（mmol/L）和Taq酶濃度（U）在4個(gè)水平上進(jìn)行比較篩選，L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

1.2.4最適退火溫度篩選。

利用篩選出的SSR引物，根據(jù)各引物Tm值，選取48～56 ℃之間9個(gè)梯度的退火溫度進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)退火溫度下的SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較，確定各引物的最適退火溫度。

1.2.5SSR-PCR優(yōu)化體系驗(yàn)證。

從篩選出的SSR引物中隨機(jī)選取一個(gè)引物，同時(shí)從53個(gè)茶樹DNA模板中隨機(jī)選取12個(gè)，根據(jù)2%瓊脂糖電泳檢測(cè)和10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）[18]的擴(kuò)增結(jié)果綜合判斷福建省茶樹SSR-PCR優(yōu)化體系是否可靠。

2結(jié)果與分析

2.1SSR引物篩選結(jié)果

根據(jù)電泳結(jié)果顯示，23對(duì)引物中篩選出5對(duì)擴(kuò)增結(jié)果符合預(yù)期的引物（G2、G6、G16、G19、G22），擴(kuò)增條帶單一、清晰明亮、無(wú)嚴(yán)重拖帶、擴(kuò)增效果最佳（圖1）。另外18對(duì)SSR引物存在擴(kuò)增條帶多且不夠清晰明亮的問(wèn)題。

2.2SSR-PCR體系優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)茶樹SSR-PCR反應(yīng)L16（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果如圖2所示，16個(gè)組合中有10個(gè)組合的擴(kuò)增條帶明亮，3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、11號(hào)和12號(hào)組合存在非特異性擴(kuò)增條帶；1號(hào)、2號(hào)和7號(hào)主帶明顯，無(wú)非特異性擴(kuò)增條帶，其中7號(hào)組合擴(kuò)增出的條帶最為清晰明亮、單一、穩(wěn)定性最好且無(wú)其他雜帶，因此7號(hào)組合為最佳的SSR-PCR反應(yīng)體系，該體系的組合為DNA模板50 ng/μL、引物0.25 mmol/L、Taq酶1.25 U。

2.3最適退火溫度的確定

退火溫度影響SSR引物與DNA模板的特異性結(jié)合，利用之前篩選出來(lái)的G2、G6、G16、G19和G22這5對(duì)最佳的SSR引物進(jìn)行退火溫度PCR擴(kuò)增，PCR電泳結(jié)果（表3）表明退火溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，PCR擴(kuò)增條帶都不太理想；當(dāng)退火溫度為50～51 ℃時(shí)，各引物擴(kuò)增的譜帶清晰豐富，因此確定后續(xù)SSP-PCR擴(kuò)增體系驗(yàn)證時(shí)的各引物的最佳退火溫度。

2.4SSR-PCR擴(kuò)增體系驗(yàn)證分析

在篩選出的G2、G6、G16、G19、G122這5對(duì)SSR引物中隨機(jī)選取G6引物，并從53份茶樹種質(zhì)資源中隨機(jī)選取12份DNA模板進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增體系驗(yàn)證，根據(jù)2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可知擴(kuò)增條帶清晰明亮、單一、平整無(wú)雜帶（圖3）；同時(shí)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）擴(kuò)增電泳結(jié)果顯示SSR-PCR擴(kuò)增體系擴(kuò)增出的條帶清晰、多態(tài)性較強(qiáng)（圖4），以上結(jié)果表明該SSR-PCR優(yōu)化體系具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，適用于福建省茶樹種質(zhì)資源的SSR分析研究。

3結(jié)論與討論

SSR分子標(biāo)記檢測(cè)過(guò)程中最重要的環(huán)節(jié)就是PCR擴(kuò)增，建立穩(wěn)定的SSR-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序是SSR分析的必要前提。而SSR-PCR反應(yīng)體系涉及諸多因素，各因素均可能對(duì)PCR擴(kuò)增的敏感性、特異性和擴(kuò)增產(chǎn)量產(chǎn)生影響[19]，如用未優(yōu)化的SSR-PCR體系進(jìn)行試驗(yàn)，會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性大大降低，不利于SSR分子標(biāo)記發(fā)揮其應(yīng)有的作用，從而進(jìn)一步影響到后續(xù)的遺傳關(guān)系鑒定、親緣分析、雜交親本的選育、遺傳圖譜構(gòu)建工作的開展[20]。一般進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的方法有2種，分別為正交試驗(yàn)法和單因素試驗(yàn)法。單因素試驗(yàn)法過(guò)程繁瑣，需要根據(jù)各個(gè)因素的改變進(jìn)行反復(fù)多次試驗(yàn)，耗費(fèi)成本高，且各因素間的互作效應(yīng)易被忽略[21]。相比單因素試驗(yàn)法，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)就完全避免了以上缺陷。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)既能做到分散性效果均衡檢測(cè)，又能綜合分析比較各個(gè)因素的互作影響，還可以對(duì)單個(gè)因素水平不同時(shí)的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)分析。該研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，通過(guò)DNA模板和引物的隨機(jī)抽取，盡量降低偶然性誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響[22]，并進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）SSR-PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化的驗(yàn)證，從多方面確保SSR-PCR優(yōu)化體系結(jié)果的準(zhǔn)確可靠[8]。

在SSR-PCR體系優(yōu)化試驗(yàn)中，當(dāng)DNA模板、引物和Taq酶濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增的重復(fù)性下降、堿基錯(cuò)配、形成引物二聚體和非特異性產(chǎn)物產(chǎn)生[23]。同時(shí)，退火溫度直接影響PCR的擴(kuò)增效率和擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，過(guò)低的退火溫度易產(chǎn)生多條雜帶，不利于后續(xù)條帶統(tǒng)計(jì)分析，過(guò)高則PCR擴(kuò)增準(zhǔn)確度下降，目的條帶模糊。因此須對(duì)不同引物進(jìn)行退火溫度篩選，以確定各引物的最適退火溫度[24]。

經(jīng)過(guò)SSR-PCR優(yōu)化體系和驗(yàn)證試驗(yàn)，確認(rèn)福建省茶樹種質(zhì)資源最佳SSR-PCR反應(yīng)體系為Taq酶1.25 U（12.5 μL）、ddH2O 9.5 μL、DNA模板1 μL（濃度50 ng/μL）、上下游引物各1 μL（濃度0.25 mmol/L），總體積25 μL。在這個(gè)反應(yīng)體系下進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化驗(yàn)證，得到的條帶清晰明亮、平整、無(wú)雜帶和拖帶。表明該SSR-PCR優(yōu)化體系穩(wěn)定、可靠、重復(fù)性良好，可以進(jìn)一步用于福建省茶樹種質(zhì)資源親緣關(guān)系分析、優(yōu)良品種選育等研究，為現(xiàn)有福建省珍稀茶樹種質(zhì)資源的鑒別和保護(hù)，建立省級(jí)優(yōu)良茶樹種質(zhì)資源的SSR指紋圖譜，以及福建省茶樹核心種質(zhì)資源庫(kù)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

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