崔永濤 林佳 李廣宏 王方海

摘要 [目的]了解蛻皮激素活性類化合物RH-2485對重要害蟲斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲蛻皮的影響。[方法]用2 μL 100 mg/L RH-2485點滴處理斜紋夜蛾5齡幼蟲，觀察幼蟲蛻皮和發(fā)育情況，并制作石蠟切片，在顯微鏡下觀察被處理幼蟲和對照幼蟲體壁間的差異。[結(jié)果]處理6 h后，大部分試蟲停止取食，接近死亡狀態(tài)；12 h后，頭殼開始出現(xiàn)脫離；24 h后，可明顯觀察到頭殼脫離現(xiàn)象，新表皮和舊表皮同時存在，舊表皮松軟地覆蓋于新表皮之上；36 h后，表皮顏色變黑，蟲體變小；48 h后，蟲體仍蛻不掉舊表皮，部分呈現(xiàn)出“細腰”狀態(tài)，或伴有后腸脫出、血淋巴流失等，多數(shù)化蛹前死亡，少數(shù)形成畸形蛹，但因不能正常羽化而死亡。同時在顯微水平上觀察到RH-2485處理后的幼蟲體壁較對照有明顯變化，在上表皮+外表皮和真皮細胞之間形成較大的間隙，真皮細胞層明顯變薄。[結(jié)論]RH-2485可嚴重干擾斜紋夜蛾的正常蛻皮，從而導(dǎo)致其死亡。

關(guān)鍵詞 RH-2485；斜紋夜蛾；蛻皮

中圖分類號 Q965文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0149-04

Abstract [Objective] The aim was to explore the effect of RH2485，a kind of nonsteroids two acylhydrazine compounds with molting hormone activity，on the molt of Spodoptera litura，an important pest of agriculture.[Method] The 5th instar larvae of S.litura were treated with 100 mg/L RH2485，and their molt and development were observed.The difference between the treated larva and the control larva body wall was observed under the microscope by the Paraffin section.[Result] Most insects stop feeding and with the sublethal status after 6 h； the cuticle of head was out after 12 h；there were old and new skin at the same time，and the old skin soft covered on top of the new skin after 24 h； skin color was black and body became small after 36 h； the old skin was still existence，some showing ‘waist，or accompanied by intestinal prolapse，blood and lymphatic drain，most died before pupation，a small number of pupae formed with malformation and died before eclosion after 48 h.Observed on the micro level，the larval body wall had obvious changes compared with the control as followed：a large gap was formed between the upper epidermis & the outer epidermal and dermal cells，and the dermal cell layer became thin.[Conclusion] The RH2485 can seriously interfere with the normal molting of Spodoptera litura，leading to its death.

Key words RH2485； Spodoptera litura；Molting

蛻皮激素是調(diào)控昆蟲生長發(fā)育的重要激素，可以啟動昆蟲舊表皮的溶解和新表皮的形成[1]。人們曾經(jīng)試圖將蛻皮激素開發(fā)為新型殺蟲劑，但由于天然蛻皮激素在分離和提取方面比較困難、成本過高等原因，未能獲得應(yīng)用和推廣。因此，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)家轉(zhuǎn)而合成和篩選可以模擬蛻皮激素作用的各類化合物，且成功開發(fā)出新的殺蟲劑[2]。二酰基肼類化合物是人工合成的非類固醇類蛻皮激素激活物，可作用于蛻皮激素受體，導(dǎo)致蟲體過早蛻皮，使其發(fā)育有所殘缺或最終死亡。深入研究發(fā)現(xiàn)，這類化合物處理后的試蟲能啟動早期基因的表達，引發(fā)蛻皮，但由于其在昆蟲體內(nèi)不易降解，持續(xù)存在，進而抑制了晚期基因的表達，降低了多巴脫羧酶的活性，從而使羽化激素的釋放受到抑制，蟲體蛻皮失敗或不表現(xiàn)出蛻皮行為，常常形成“雙頭囊”而導(dǎo)致死亡，并伴有后腸脫出和血淋巴流失等癥狀，有些幼蟲則會形成畸形蛹，因不能正常羽化而死亡[3-4]。

具有蛻皮激素生物活性的雙?；骂惢衔颮H-5849、RH-5992、RH-0345都已經(jīng)成功開發(fā)為殺蟲劑，并具有明顯的作用效果[4-6]。RH-2485是近期合成的一種具有蛻皮激素活性的非內(nèi)固醇雙酰肼類化合物，生物測定結(jié)果顯示它和其他非內(nèi)固醇類殺蟲劑一樣，具有良好的生物活性。筆者曾詳細研究了RH-2485對農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)具有明顯的殺蟲效果，并具體測定了RH-2485對不同齡期斜紋夜蛾幼蟲的半數(shù)致死濃度等[7]。筆者擬在前期研究的基礎(chǔ)上，利用石蠟切片技術(shù)，研究這種新型昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對繁殖能力和抗藥性都很強的農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾[8-9]蛻皮過程及新表皮形成的影響，并探討該化合物引發(fā)不正常蛻皮的機制，以期為在田間更好地利用RH-2485防治斜紋夜蛾提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲。斜紋夜蛾幼蟲由中山大學(xué)昆蟲學(xué)研究所養(yǎng)蟲室提供，用人工飼料飼養(yǎng)，人工飼料配方參考陳其津等[10]報道的方法，飼養(yǎng)條件為：溫度（28±1） ℃、相對濕度60%～75%、光暗周期16 h/8 h。

1.1.2 RH-2485。具有蛻皮激素活性的化合物RH-2485購于美國Rohm-Haas公司，純度在99%以上。將RH-2485粉末用二甲基亞砜（DMSO）溶解，稀釋成100 mg/L溶液待用。

1.1.3 主要試劑。Carnoy 固定液：無水乙醇60 mL，冰醋酸10 mL，氯仿30 mL。蛋白膠：雞蛋1枚，取出蛋清，加等量甘油，用玻棒攪拌混勻后，加入0.5 mg麝香草酚，放入4 ℃冰箱中保存待用。蘇木精染液：蘇木精2 g，鉀礬10 g，冰醋酸10 mL，無水乙醇、甘油和蒸餾水各100 mL。首先用25 mL無水乙醇及冰醋酸溶解蘇木精，順次加入甘油、剩余75 mL無水乙醇，然后將甲礬加入蒸餾水中，加熱使其全部溶化，再緩慢倒入蘇木精液中，攪勻后待用。伊紅染色劑：將1 g伊紅加入100 mL 95%乙醇中，攪拌均勻即可。

1.2 方法

1.2.1 RH-2485處理斜紋夜蛾5齡幼蟲后蛻皮過程的形態(tài)觀察。根據(jù)頭殼寬度，選取發(fā)育基本一致的斜紋夜蛾5齡幼蟲，用移液槍吸取2 μL 100 mg/L RH-2485點滴在蟲體前胸背板上，以DMSO處理組為對照。全程觀察其蛻皮過程并進行拍照。

1.2.2 RH-2485處理后斜紋夜蛾5齡幼蟲表皮的石蠟切片制作和觀察。具體切片方法參照暴學(xué)祥等[11]的方法，主要包括固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、切片、粘片、染色等步驟。從二甲苯試劑中取出切片時，需清除玻片周圍及底部的二甲苯，再滴加樹膠，蓋上蓋玻片，然后封片，并粘上標簽，平放晾干。采用熒光體視顯微鏡（ZEISS SteREO Lumar.V12）觀察切片并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RH-2485處理斜紋夜蛾5齡幼蟲后的形態(tài)觀察 處理后6 h，試蟲大部分停止取食，接近死亡狀態(tài)；12 h后，頭殼開始出現(xiàn)脫離；24 h后，可明顯觀察到頭殼脫離現(xiàn)象，新表皮和舊表皮同時存在（圖1），舊表皮松軟地覆蓋于新表皮之上；36 h后，蟲體表皮顏色逐漸變黑，蟲體開始皺縮；48 h后，舊表皮仍然不能蛻去，多數(shù)試蟲瀕臨死亡或已死亡，部分呈現(xiàn)出“細腰”狀態(tài)（圖2）。還伴有后腸脫出（圖3）、血淋巴流失等其他中毒癥狀。有些可以發(fā)育到末齡幼蟲，但形成畸形蛹（圖4），且因不能正常羽化而死亡。

2.2 RH-2485處理后幼蟲表皮的顯微觀察 通過顯微鏡觀察及拍照，RH-2485處理后斜紋夜蛾的表皮顯微結(jié)構(gòu)見圖5。

通過顯微鏡觀察，斜紋夜蛾體壁大體可區(qū)分出3個明顯的結(jié)構(gòu)，由外向內(nèi)依次為上表皮+外表皮、中表皮+內(nèi)表皮、真皮。與對照相比，經(jīng)RH-2485處理后的幼蟲體壁發(fā)生了明顯變化，如上表皮+外表皮與真皮細胞之間形成大的間隙，真皮細胞層明顯變薄。

3 結(jié)論與討論

全變態(tài)的昆蟲幼蟲要經(jīng)歷多次蛻皮過程才能化蛹，然后羽化為成蟲。一般情況下，皮細胞比較扁平，表皮緊緊地黏附于皮細胞。當(dāng)蛻皮過程開始時，皮細胞及其附近組織開始儲存和積累部分物質(zhì)，并逐漸長大。隨后，皮細胞細胞質(zhì)突起從通道中收縮回來，表皮和皮細胞出現(xiàn)分離。與此同時皮細胞不斷分裂而增多，且不斷增大，然后在皮細胞的表面分泌形成新的表皮質(zhì)層。在新舊表皮之間含有由皮細胞、皮腺或馬氏管等分泌的大量蛻皮液。而蛻皮液內(nèi)含有幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等，可消化舊表皮的內(nèi)層，使80%～90%的舊表皮被消化掉，剩下的只是不能消化的上表皮和鞣化的外表皮，消化后的產(chǎn)物多數(shù)被皮細胞吸收，用于新表皮的形成。在蛻皮前幾小時分泌出新的蠟層，經(jīng)由孔道鋪在新表皮之上；然后再從皮腺分泌膠粘層鋪于蠟層之上。表皮質(zhì)層、蠟層、膠粘層等組成上表皮。此時蛻皮液大部分被吸收，由于昆蟲身體的運動和收縮，導(dǎo)致蛻皮線處裂開，昆蟲由此從舊表皮內(nèi)爬出，這就是蛻皮過程[12]。整個蛻皮活動的起始及過程的結(jié)束是由蛻皮激素所調(diào)控的[13]。

蛻皮激素類似物RH-2485處理斜紋夜蛾幼蟲后，必將影響其體內(nèi)蛻皮激素的滴度變化，從而干擾其正常的蛻皮。該研究發(fā)現(xiàn)，RH-2485處理斜紋夜蛾幼蟲后，可以啟動斜紋夜蛾的蛻皮，形成一個未鞣化的新頭殼，但是無法退去，經(jīng)歷一段時間，有些可以形成一種“細腰”結(jié)構(gòu)，是表皮無法正常蛻皮所導(dǎo)致，幼蟲保持這種狀態(tài)幾天，最后死于饑餓和脫水，同時伴有后腸脫出，血淋巴流失的癥狀。因此這種蛻皮是早熟、致死的蛻皮。即使有些幼蟲到了末齡，可以形成畸形蛹，卻不能正常羽化而死亡。而杜育哲等[3]于2002年用同系列早期產(chǎn)品RH-5992對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）4齡幼蟲的蛻皮進行了研究，同樣觀察到了“雙頭囊”致死、后腸脫出和畸形蛹等現(xiàn)象。

斜紋夜蛾體壁可以區(qū)分出3個明顯的結(jié)構(gòu)，由外向內(nèi)依次為上表皮+外表皮、中表皮+內(nèi)表皮、真皮。與正常蛻皮相比，RH-2485處理后，幼蟲體壁較對照有明顯變化：上表皮+外表皮與真皮細胞之間形成大的間隙，真皮細胞層明顯變薄?？梢钥闯?，皮細胞的形態(tài)、表皮序列的變化都和正常相似，但RH-2485處理后的真內(nèi)皮變薄，新真皮增長緩慢，蟲體不表現(xiàn)出蛻皮行為而死亡。用同系列早期產(chǎn)品RH-5849、RH-5992等處理甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）[14]、云杉色卷蛾（Choristoneura fumiferana）[15]都觀察到類似的現(xiàn)象和癥狀。說明新合成的蛻皮激素類似物RH-2485與早期產(chǎn)品RH-5849、RH-5992等一樣，可誘導(dǎo)早期基因的表達，啟動蛻皮，但該類化合物在昆蟲體內(nèi)不易降解，持續(xù)存在，抑制了部分后期基因的表達，從而導(dǎo)致不正常的、致死的蛻皮[5-6]。

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