王龍　宋維君　劉霍

摘要[目的]研究托素鹽堿湖真菌多樣性及菌群在不同環(huán)境中的適應(yīng)規(guī)律。[方法]選取典型的缺氧、干旱、高海拔且具有穩(wěn)定淡水補(bǔ)給的堿性封閉咸水湖泊托素湖為研究對象，分別對6個取自同一湖泊不同地理位置及不同鹽度水體的樣本提取總DNA后，對真菌16S rRNA基因進(jìn)行Illumina Miseq高通量測序，研究樣本中真菌群落結(jié)構(gòu)差異及多樣性。[結(jié)果]子囊菌門Ascomycota及擔(dān)子菌門Basidiomycota為鹽度較高樣本中的優(yōu)勢真菌，而纖毛門Ciliophora及P1-31門為鹽度較低樣本中的絕對優(yōu)勢菌群。[結(jié)論]托素湖真菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，類群豐富，其真菌群落結(jié)構(gòu)受水體鹽度及pH影響較大。

關(guān)鍵詞真菌；多樣性；托素湖

中圖分類號S182文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2018）25-0060-04

Diversity of Fungi in Tuosu Saline Lake，Qaidam Basin

WANG Long，SONG Weijun，LIU Huo

（School of Chemical Engineering，Qinghai University，Xining，Qinghai 810016）

Abstract[Objective]The diversity of fungi and the adaptability of flora in different environments were studied. [Method]The total DNA was extracted from six samples which different in salinity from different geographical locations of Tuosu Lake. The 16S rRNA gene of bacterial and archaeal were determined by using highthroughput sequencing based on an Illumina Miseq sequencing platform. [Result]The Ascomycota and Basidiomycota were dominant genus in the highsalt sample，while Ciliophora and P1-31 were more advantageous in the samples with lower salinity. [Conclusion]The fungus community in Tuosu Lake is complex in structure and rich in species. Fungal community structure appears to be highly influenced by water salinity and pH.

Key wordsFungi；Diversity；Tuosu Lake

托素湖位于青藏高原柴達(dá)木盆地，因其具有低溫、高海拔、高鹽度、高堿、高紫外輻射強(qiáng)度等特征，可作為一種典型的極端水環(huán)境，在以托素湖為代表的高原湖泊極端生態(tài)環(huán)境中，微生物物種結(jié)構(gòu)及多樣性方面具有很高的研究價(jià)值。湖泊中微生物的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)組成是評價(jià)其所在生態(tài)系統(tǒng)健康穩(wěn)定的重要指標(biāo)[1-3]。高原湖泊中的微生物易受高原環(huán)境的影響，因此開展高原湖泊中微生物菌群結(jié)構(gòu)及物種多樣性研究能更好地了解高原湖泊生態(tài)系統(tǒng)中微生物資源與環(huán)境變化之間的相互關(guān)系，具有重要的研究意義。作為水體微生物的重要成員，高原湖泊中的水生真菌（aquatic fungi）具有十分重要的生態(tài)功能，并與其他細(xì)菌、古菌等微生物一起推動著湖泊生態(tài)系統(tǒng)的能量流動和物質(zhì)循環(huán)，維持生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，是生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分[4-5]。近年來，科學(xué)工作者對各種湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的真菌種類和構(gòu)成進(jìn)行了研究，對豐富真菌資源、開發(fā)新的功能菌株和維護(hù)水體生態(tài)系統(tǒng)及整個生態(tài)系統(tǒng)的健康發(fā)展都起著積極的推動作用。

水生真菌是指生長在淡水和海水中的真菌，生活在水體中并能完成生活史的真菌。狹義的水生真菌僅指淡水真菌。由于長期適應(yīng)水這個特殊生態(tài)環(huán)境，它們形成能在水中游動的游動孢子、游動配子、游動合子以及便于漂浮和棲息的絲狀孢子、四枝孢子、星狀孢子等[4]。廣義的水生真菌包括淡水真菌、海水真菌和污水真菌。在全球水體面臨污染的今天，不管是鑒別污水還是處理污水，或是在探討真菌的起源和演化中，水生真菌的研究都非常重要。水中基物，水層深淺，以及水的清濁、光線、溫度、氧、酸堿度、水域海拔等都對水生真菌的分布產(chǎn)生影響。因此，對托素湖真菌多樣性及其分布進(jìn)行研究可揭示微生物的多樣性及菌群在不同環(huán)境中的適應(yīng)規(guī)律，為更好地探索開發(fā)高原微生物資源提供生物學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1采樣點(diǎn)簡介托素鹽堿湖位于青藏高原柴達(dá)木盆地東部，湖區(qū)屬于荒漠半荒漠的大陸性氣候，冬長夏短，干旱少雨，年平均氣溫3 ℃，7月平均氣溫16.7 ℃，平均海拔2 800 m，年降水量100 mm，由于地處高原，日照充足，紫外線輻射強(qiáng)度較高，年輻射量572 kJ/cm2，托素湖水主來源于其北部淡水湖泊克魯克湖的補(bǔ)給，兩湖有河道相通。托素湖周皆為茫茫戈壁，僅在河道入湖處有稀疏的蘆葦和少量的浮游生物，湖區(qū)有零星白刺等植物。

試驗(yàn)于2016年9月分別在托素湖河道入口處沿水流方向采集樣品，具體采樣點(diǎn)位物理化學(xué)性質(zhì)見表1。用分層水質(zhì)采樣器取表層和底層水混合，取200 mL湖水，然后抽濾到0.22 μm的聚碳酸酯膜上，在基因組DNA提取前，將濾膜放于-20 ℃低溫冰箱保存。采集T-a、T-b、T-c、T-d、T-e、T-f共6個點(diǎn)0～10 cm表層沉積物樣品，取每點(diǎn)的3個平行泥樣混合密封好后放入車載低溫保溫箱儲藏，帶回實(shí)驗(yàn)室后立即于-20 ℃冰箱保存。

1.2樣品總DNA提取及16S rRNA基因PCR擴(kuò)增將所采湖水及沉積物樣品混勻，取出20～50 mL放入無菌離心管中，分別標(biāo)記，室溫12 000 r/min離心20 min，緩緩棄去上清液，將離心管底部沉淀與剩余的少量液體混合均勻后轉(zhuǎn)移至2 mL無菌離心管中，室溫12 000 r /min再離心20 min，用微量移液器小心吸取并棄去上清液，留下的沉淀用于總DNA提取?？侱NA的提取步驟按照 AxyPrepTM 細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒說明進(jìn)行，并將提取到的 DNA 立刻冷藏于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增過程中，引物使用SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。每個樣本3個重復(fù)，同一樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.3測序及分析將經(jīng)過純化檢測合格的PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行16SrRNA基因（V4～V5區(qū)）高通量測序，測序平臺采用Illumina Miseq，測序工作交由上海美吉生物科技有限公司完成，Silva數(shù)據(jù)庫比對。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個分類水平：domain（域）、kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.4不同采樣點(diǎn)水體理化性質(zhì)測定在取樣現(xiàn)場，利用便攜式pH計(jì)測定水樣pH，利用便攜式鹽度計(jì)測定水體總鹽（TS），所有水體樣本的理化性質(zhì)測定工作均在取樣后7 d內(nèi)完成，總氮（TN）、總磷（TP）、總有機(jī)碳（TOC）的測定由上海譜尼測試有限公司完成。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2018年

2結(jié)果與分析

2.1真菌群落結(jié)構(gòu)分析

由圖1可知，該試驗(yàn)所采6個樣品共獲得真菌種類為11界（kingdom）32門（phylum）50綱（class）63目（order）75科（family）94屬（genus）118種（species），物種注釋（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目為179。其中11個門屬所占比例超過1%，子囊菌門Ascomycota （30.83%）、隱藻門Cryptomonadales（18.95%）、纖毛門Ciliophora（12.31%）、未被分類的真菌unclassified_d__Eukaryota （10.36%）、領(lǐng)鞭毛門Choanoflagellida （8.55%）、擔(dān)子菌門Basidiomycota （5.54%）、普林藻門Prymnesiophyceae （259%）、壺菌門Chytridiomycota（2.05%）和無法歸類的菌群unclassified_k__norank （1.25%）及

未明確分類的真菌norank_d__Eukaryota （1.03%）。樣本中存在含量超過1224%的unclassified及norank的菌群，表明在托素湖中存在著大量尚未被鑒定和分類的真菌類微生物。

基于真菌屬水平類群α多樣性分析結(jié)果顯示，樣本Chao值為46.00～59.75，Shannon指數(shù)為1.66～2.79，Simpson指數(shù)為0.10～0.30。所有樣本中，T-b樣本群落多樣性最高，Shannon指數(shù)為2.79，而T-a樣本群落多樣性最低，Shannon指數(shù)為1.66。Luo等[6]通過研究撫仙湖和滇池湖水中基質(zhì)上的水生真菌，發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)水平較低的撫仙湖真菌多樣性高于營養(yǎng)水平較高的滇池，水生真菌多樣性對于水體富營養(yǎng)化的此種響應(yīng)在一些淡水湖泊中的微型浮游生物、大型浮游動物多樣性方面均有所表現(xiàn)。

由圖2可知，托素湖河道入湖口處的樣本真菌類群與其他樣本有著明顯的區(qū)別。在樣品T-a中，真菌主要屬于纖毛門Ciliophora（47.35%）及P1-31（34.04%）門，其次為隱藻門Cryptomonadales（7.66%）和領(lǐng)鞭毛類Choanoflagellida（3.19%）。在鹽度相對較高的幾個樣本中，子囊菌門Ascomycota含量相對較高，其中T-b（59.99%）、T-c（60.06%）、T-d（16.80%）、T-e（21.97%）及T-f （24.48%），而Ascomycota在樣品T-a中含量僅為（0.41%）。含鹽量較低的樣本中優(yōu)勢真菌纖毛門Ciliophora在鹽度含量較高的幾個樣本中含量有了明顯下降，分別為T-b（14.27%）、T-c（12.25%）、T-d（394%）、T-e（16.13%），在樣品T-f中的含量僅為（041%），P1-31（34.04%）門類真菌在鹽度較高的樣本中的含量急劇下降，所有高鹽樣本中的含量均小于0.10%，幾乎可以忽略?？傮w而言，托素湖中真菌的分布及其群落結(jié)構(gòu)與水體鹽度存在密切關(guān)系。其中子囊菌Ascomycota及擔(dān)子菌Basidiomycota為鹽度較高的樣本中的優(yōu)勢真菌。已有研究[7-8]表明子囊菌可能對于水體營養(yǎng)水平的變化具有很好的指示作用，子囊菌生長可能依賴于可溶性碳水化合物這樣較易利用能源，可分解纖維素、木質(zhì)素，而擔(dān)子菌主要通過產(chǎn)生木質(zhì)素修飾酶，以降解木質(zhì)素為生。托素湖屬典型的貧營養(yǎng)湖泊，湖周皆為茫茫戈壁，從碳循環(huán)角度來看，上游淡水克魯克湖中的水草及湖區(qū)植被可為托素湖微生物提供纖維素、木質(zhì)素等碳源，可以初步推測鹽度較高樣本中的子囊菌Ascomycota及擔(dān)子菌Basidiomycota在托素湖泊生態(tài)體系中主要承擔(dān)了分解纖維素、木質(zhì)素的功能，其代謝產(chǎn)物又為后續(xù)微生物代謝提供了所需碳源。

2.2托素湖真菌系統(tǒng)發(fā)育分析選擇科水平上分類信息對應(yīng)的序列，根據(jù)最大似然法（approximatelymaximumlikelihood phylogenetic trees）構(gòu)建進(jìn)化樹，并使用R語言作圖繪制進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示。通過比較分析，結(jié)果表明托素湖真菌種類相對豐富且聚類分支復(fù)雜，結(jié)果表明這些序列主要?dú)w屬于真菌界的子囊菌門（Ascomycota）：格孢菌科（Pleosporales）、酵母菌科（Saccharomycetales）、水松科（Dipodascaceae）、迷迭科（Didymellaceae）和格孢腔菌科（Pleosporales）等；擔(dān)子菌門（Basidiomycota）：外擔(dān)子菌亞綱馬拉色菌科（Malasseziales）、外擔(dān)子菌科（Exobasidiomycetes）、孢霉擔(dān)子菌科（Cystofilobasidiaceae）等。

2.3托素湖真菌熱圖分析在屬水平上對6個樣品OTU進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示T-b與T-c聚在一起，T-d與T-e聚在一起后又與T-f聚在一起，所有樣本中T-a較其他樣本親緣關(guān)系遠(yuǎn)，單獨(dú)分出一支，這一結(jié)果與多樣性的結(jié)果較相似。從水體鹽度角度分析，淡水領(lǐng)鞭毛類Freshwater-Choanoflageuates、環(huán)毛亞綱的Choreotrichia屬、隱藻類的Kathablepharidae屬在低鹽樣本T-a中的豐度明顯高于其他樣品，而Trichocomaceae屬（發(fā)菌科）、蟲草屬Cordyciptaceae、Guillardia屬在高鹽樣本中屬于絕對優(yōu)勢種屬。說明真菌屬的分布與水體鹽度具有明顯的相關(guān)性。已有研究表明[9]，鹽度對木生真菌有重要影響，諸如半知菌（Phoma sp.、Macrophoma sp.、Piricauda sp.、Stagonospora sp.、Trichocladium sp.）在淡水、半咸水中大量分布，而在超過28.9‰鹽度的河水中沒有半知菌存在。

2.4湖水理化性質(zhì)對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響圖5為基于門水平的采樣點(diǎn)、菌群、環(huán)境因子之間對應(yīng)CCA分析。圖中樣本點(diǎn)的空間距離代表樣本間的距離，分類型環(huán)境因子點(diǎn)與樣本點(diǎn)距離代表樣本受環(huán)境因子影響程度，樣本點(diǎn)到數(shù)量型環(huán)境因子向量的投影距離代表樣本受環(huán)境因子影響的程度。結(jié)果表明T-b和T-c，T-d和T-e樣品點(diǎn)之間距離較其他點(diǎn)近，表明其真菌群落構(gòu)成也較為相似，而T-f、T-a樣品點(diǎn)與其余4點(diǎn)相對較遠(yuǎn)，T-a與其余5個樣本點(diǎn)距離最遠(yuǎn)。說明樣本T-a中的真菌群落組成與其他各點(diǎn)有較大差異。環(huán)境因子中，總鹽度（TS）、總有機(jī)碳（TOC）、pH對樣品真菌群落結(jié)構(gòu)組成影響相對較大，總氮（TN）對樣品中的真菌群落組成較其他因素相對較弱。子囊菌門Ascomycota，未被分類的真菌unclassified_d__Eukaryota，擔(dān)子菌門Basidiomycota和無法歸類的菌群unclassified_k__norank及未明確分類的真菌norank_d__Eukaryota與TS、TOC、pH呈正相關(guān)。領(lǐng)鞭毛門Choanoflagellida、隱藻門Cryptomonadales與TN呈正相關(guān)。Hallsworth等[10]研究表明，pH能夠影響真菌繁殖體中多元醇和海藻糖的濃度，這2種物質(zhì)在滲透壓調(diào)節(jié)方面起著重要作用，而且其在細(xì)胞中的含量與真菌適應(yīng)極端環(huán)境和提高真菌繁殖體貯藏壽命有關(guān)。

3結(jié)論

采用高通量技術(shù)對托素鹽堿湖泊不同采樣點(diǎn)6個樣本中的真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，托素湖中真菌的空間變化特征與環(huán)境因子關(guān)系密切，生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境因子的改變直接影響著真菌菌群結(jié)構(gòu)及其豐度，同時(shí)真菌群落結(jié)構(gòu)特征在一定程度亦反映了托素湖水體的生態(tài)環(huán)境狀況。研究結(jié)果表明，子囊菌門Ascomycota及擔(dān)子菌門Basidiomycota為鹽度較高的樣本中的優(yōu)勢真菌，而纖毛門Ciliophora及P1-31門為鹽度較低樣本中的絕對優(yōu)勢菌群。高原湖泊中真菌的功能特性和在群落和生態(tài)系統(tǒng)中所發(fā)揮的作用還需要更深入的研究，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、病害防治、生態(tài)保護(hù)和真菌資源開發(fā)提供更有力的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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MONCHY S，SANCIU G，JOBARD M，et al. Exploring and quantifying fungal diversity in freshwater lake ecosystems using rDNA cloning/sequencing and SSU tag pyrosequencing[J]. Environmental microbiology，2011，13（6）：1433-1453.