王波 黃忠勤 丁震乾 常勇 周澗楠 蘇在興 周興根

摘要 [目的]建立甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢體系，為甘薯黑斑病品種抗性鑒定以及藥劑生物測定奠定基礎(chǔ)。[方法]采用3種方法制備甘薯黑斑病菌甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）孢子懸浮液，研究甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢方法。[結(jié)果]洗滌PDA和洗滌薯片培養(yǎng)5～ 6 d后鏡檢孢子懸浮液，一個視野內(nèi)孢子數(shù)分別約為93、95個。利用PS培養(yǎng)液培養(yǎng)1、2、4 d后鏡檢孢子數(shù)分別為 211、136、137個。[結(jié)論]采用PS液體培養(yǎng)基在特定培養(yǎng)條件下?lián)u培1 d即可獲得大量高濃度孢子懸浮液，極大地縮短了黑斑病菌產(chǎn)孢時間，顯著提高了產(chǎn)孢量，且不易污染。

關(guān)鍵詞 甘薯黑斑病;孢子懸浮液;制備方法

中圖分類號 S435.311文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0127-03

甘薯（Ipomoea batatas Lam.）在我國每年的種植面積約500萬hm 占世界甘薯種植面積的50%左右[1]。甘薯黑斑?。╯weeppotato black rot）是甘薯栽培和貯藏中的主要病害之一，在世界各甘薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其病原菌為甘薯長喙殼菌（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted），該菌分布廣泛、種群分化復(fù)雜，主要為害幼苗莖基部及塊根組織，引起死苗、爛床、爛窖，對甘薯生產(chǎn)影響極大[2]。帶有黑斑病菌的病薯中含有甘薯黑疤霉酮等物質(zhì)，家畜食用后可引起中毒癥狀[3];用病薯做發(fā)酵原料會延緩發(fā)酵過程，降低乙醇產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴重制約甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，甘薯黑斑病的防治主要是以選育抗病品種及化學(xué)殺菌劑防治為主[4-5]。而甘薯抗病育種及藥劑篩選都需要大量的孢子懸浮液進行試驗。目前主要采用薯片法和黑斑病菌平板洗滌孢子法制備孢子懸浮液，但這2種方法耗時較長。同時，薯片法制備的孢子懸浮液由于無法保證全程無菌操作，不可避免地會被雜菌污染[6];而采用傳統(tǒng)的從黑斑病平板中洗滌孢子過濾的方法耗時長效率低，無法快速大量地為藥劑篩選和抗藥性風(fēng)險評估等提供試驗所需的分生孢子懸浮液。因此，建立一種甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢的技術(shù)體系是甘薯黑斑病精準抗病鑒定、甘薯黑斑病藥劑生物測定以及抗藥性風(fēng)險評估等研究的重要條件之一。筆者研究甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢方法，旨在建立一種新型的甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑斑病菌的分離和純化：從甘薯窖中采集黑斑病發(fā)病薯塊，采用組織分離法分離甘薯黑斑病菌。首先清洗薯塊表面，然后用自來水流水沖洗約20 min，將帶病薯塊取出擦干置于超凈工作臺中，取黑斑病病健交接部位置于75%乙醇中進行表面消毒，再用0.1 %的升汞消毒后，用滅菌水清洗干凈后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板中培養(yǎng)，經(jīng)分離純化以及柯赫氏法則驗證確定后保留菌株。該菌株分離并保存于4 ℃冰箱中。

黑斑病菌培養(yǎng)：打取PDA平板中的菌碟，每個三角瓶中接種10 ～ 12個菌碟，將接種好的三角瓶置于30 ℃恒溫搖床中120 r/min搖培24 h。

孢子懸浮液制備：將搖培獲得的懸浮液用紗布過濾去除菌絲后，鏡檢測定孢子液濃度，并采用無菌水將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至試驗所需即可。

PS培養(yǎng)液的制備：馬鈴薯20 g加入1 L超純水煮沸至馬鈴薯完全爛軟，紗布過濾后加入15 g蔗糖，加超純水定容至1 L，每個三角瓶分裝30 mL，然后置于121 ℃高壓滅菌15 min備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘薯黑斑病菌最佳產(chǎn)孢方法篩選。采用PDA平板接種活化后的黑斑病菌菌碟，將接種好的平板置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～ 6 d，采用30 mL無菌水洗滌平板表面孢子，紗布過濾去除菌絲后，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野內(nèi)孢子數(shù)，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)制片3張。該方法設(shè)為對照組①。

選擇大小適中、無病蟲害侵染的薯塊洗凈自然晾干后，采用75 %乙醇表面消毒后晾干，切成厚約1 cm的薯片，把切好的薯片放入配好的孢子懸浮液內(nèi)浸一下，取出薯片晾干表面水分，再放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，期間采用紙巾或棉花團保濕紙，將接種的薯塊置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，薯片表面長滿淺灰色的分生孢子，用30 mL無菌水沖洗，紗布過濾去除菌絲后，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野內(nèi)孢子數(shù)，設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)制片3張。該方法設(shè)為對照組②。

采用馬鈴薯20 g加入1 L超純水煮沸至馬鈴薯完全爛軟，紗布過濾后加入15 g蔗糖，用超純水將培養(yǎng)液補足至1 L，每個三角瓶分裝30 mL，然后121 ℃高壓滅菌15 min備用。打取PDA平板中的菌碟，每個三角瓶中接種10～12個菌碟，將接種好的三角瓶置于30 ℃恒溫搖床中120 r/min搖培，1 d后取出，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野的孢子數(shù)。該方法為PS液體培養(yǎng)法。

1.2.2 不同培養(yǎng)時間PS液體培養(yǎng)法產(chǎn)孢量測定。采用上述PS液體培養(yǎng)法，培養(yǎng)甘薯黑斑病菌。每1、2、3、4 d取出3瓶培養(yǎng)液，每瓶培養(yǎng)液制片3張，測量孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野的孢子數(shù)，不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢數(shù)。以上述對照組①和對照組②方法培養(yǎng)5～6 d作為處理對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳產(chǎn)孢方法篩選

由圖1可知，培養(yǎng)5～ 6 d后孢子懸浮液中目鏡10倍及物鏡20倍顯微鏡下一個視野內(nèi)孢子數(shù)約為93個。由圖2可知，培養(yǎng)5～ 6 d后鏡檢孢子數(shù)約為95個，且該方法存在雜菌污染的可能性。PS液體培養(yǎng)法見圖3。由圖3可知，培養(yǎng)1 d后鏡檢孢子數(shù)為211個。

2.2 不同培養(yǎng)時間PS液體培養(yǎng)法產(chǎn)孢量

由圖4可知，使用PS液體培養(yǎng)基在特定培養(yǎng)條件下?lián)u培1 d，在放大200倍顯微鏡下每個視野均可觀察到211個孢子，與采用對照①和對照②培養(yǎng)5～6 d制備的孢子懸浮液制備方法下平均每個視野可觀察到的孢子數(shù)93和95差異極顯著;同時，對比采用PS液體培養(yǎng)基搖培0、1、2和4 d所制備的孢子懸浮液，發(fā)現(xiàn)搖培2和4 d后獲得的孢子懸浮液在同樣放大倍數(shù)的顯微鏡下平均每個視野觀察到的孢子數(shù)分別為136和137，方差分析結(jié)果表明，PS液體培養(yǎng)基搖培2和4 d比搖培1 d所得到的孢子懸浮液中平均每個視野的孢子數(shù)211顯著降低，從圖5可以看出，培養(yǎng)4 d黑斑病菌孢子已有部分開始消解。

3 結(jié)論與討論

甘薯黑斑病菌侵染薯塊后會形成黑色凹陷病斑，并在病斑及周圍產(chǎn)生有毒物質(zhì)，是造成甘薯爛窖的主要原因之一[7-8]。因此，建立甘薯黑斑病菌快速大量產(chǎn)孢的技術(shù)體系是甘薯黑斑病精準抗病鑒定、甘薯黑斑病藥劑生物測定以及抗藥性風(fēng)險評估等研究的基礎(chǔ)之一。該研究通過對比3種甘薯黑斑病產(chǎn)孢方法，建立一種新型的甘薯黑斑病產(chǎn)孢體系。該試驗采用的PS液體培養(yǎng)基在特定培養(yǎng)條件下?lián)u培1 d即可獲得大量高濃度孢子懸浮液，極大地縮短了黑斑病菌產(chǎn)孢時間，顯著提高了產(chǎn)孢量;同時由于培養(yǎng)期間全程無菌操作條件簡易可控，因此病原菌不易被污染，可以有效避免薯片法產(chǎn)孢培養(yǎng)的薯片腐爛、雜菌多、時間長等引起孢子液不純，使甘薯黑斑病抗性鑒定和甘薯黑斑病藥劑生物測定試驗更為精準高效。

參考文獻

[1]馬代夫，李洪民，唐君，等.中國甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[C]//馬代夫.甘薯與糧食能源安全——中國徐州第四屆國際甘薯學(xué)術(shù)討論會暨第四屆中日韓甘薯學(xué)術(shù)討論會論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2010：3-10.

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