韓彥龍

摘要 [目的]研究蘋果片在干制條件下及復(fù)合護(hù)色劑處理后的蛋白質(zhì)水平變化。[方法]采用Label free技術(shù)分析了蘋果片在干制條件下及復(fù)合護(hù)色劑處理后果肉中蛋白質(zhì)組學(xué)的變化。[結(jié)果]一共檢測到319個差異蛋白上調(diào)，590個下調(diào)，分別參與了多個不同的代謝途徑。其中，催化活性catalytic activity（48個差異表達(dá)蛋白）、氧化還原過程oxidationreduction process（18個差異表達(dá)蛋白）、應(yīng)激反應(yīng)response to stress（17個差異表達(dá)蛋白）等多個途徑的蛋白差異表達(dá)明顯。KEGG富集分析結(jié)果顯示，共有2個基因通路顯著富集，在氧化磷酸化Oxidative phosphorylation中有5個蛋白參與顯著富集；在代謝通路Metabolic pathways中有11個蛋白參與顯著富集。這2個途徑與抗氧化、褐變酶合成途徑有關(guān)。[結(jié)論]該研究首次在蘋果片干制條件下及復(fù)合護(hù)色劑處理后采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析差異蛋白的表達(dá)變化，為復(fù)合護(hù)色劑在實(shí)踐中果蔬護(hù)色提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 復(fù)合護(hù)色劑；蘋果片；干制；蛋白質(zhì)組學(xué)；表達(dá)分析；GO富集分析

中圖分類號 TS255.42 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）02-0070-05

Abstract [Objective] To investigate proteins expression in complex colourprotective reagents treated apple slices during drying. [Method]We analyzed proteomic change in apple slices treated with complex colourprotective reagents during drying using Label free technology. [Result]319 differential proteins were upregulated， 590 differential proteins were downregulated. They involved into different metabolism pathways， respectively. Among them， differential proteins expression in catalytic activity （48 proteins）， oxidationreduction process （18 proteins）， response to stress （17 proteins） pathways became very obvious. KEGG enrichment analysis showed that two gene pathways were obviously enriched. 5 proteins involved into Oxidative phosphorylation pathway enrichment.11 proteins involved into metabolic pathways enrichment. The two pathways were related to antioxidation and enzymes browning procedures. [Conclusion] Proteomic change in complex colourprotective reagents treated apple slices during drying was first reported. This study provided a science support to application of complex colourprotective reagents in fruits and vegetables browning inhibition.

Key words Complex colourprotective reagents；Apple slices；Drying；Proteomics；Expression analysis；GO enrichment analysis

蘋果是一種非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)的水果，新鮮蘋果經(jīng)分級、清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等處理，供消費(fèi)者立即食用或餐飲業(yè)使用。色澤是判斷加工蘋果非常重要的一個指標(biāo)，切割蘋果的主要質(zhì)量問題是褐變。由于在加工過程（如去皮、切分等）中破壞了多酚氧化酶（PPO）和酚類物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)通過一系列膜系統(tǒng)的區(qū)域化分布，因而酶和底物的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下相互接觸導(dǎo)致酶促褐變的發(fā)生，從而嚴(yán)重影響蘋果的顏色、風(fēng)味、營養(yǎng)和品質(zhì)，因此防止加工蘋果的氧化褐變尤為重要[1-2]。蘋果褐變的主要原因是其組織內(nèi)的酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的作用下氧化為醌類，而醌類物質(zhì)會進(jìn)一步聚合而形成黑色素，進(jìn)而發(fā)生酶促褐變[3]。

蛋白質(zhì)組是指由一個基因組、一個細(xì)胞或組織所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[4-5]。蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對象的新的研究領(lǐng)域，其目的在于闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)、翻譯后的修飾、蛋白結(jié)構(gòu)、蛋白與蛋白之間相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生、細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識[6-7]。蘋果片干制是保存蘋果的一種重要方法，然而在干制過程中，果肉極易發(fā)生褐變，使其商品價值大大降低，為此，研制了一種能有效降低果肉褐變的復(fù)合護(hù)色劑。筆者通過蛋白組學(xué)分析技術(shù)分析了干制蘋果片在護(hù)色前后蛋白的差異表達(dá)，為揭示復(fù)合護(hù)色劑抑制蘋果片果肉褐變的機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料紅富士蘋果購自太谷縣。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理。

洗凈蘋果，將蘋果切成 1 mm 的薄片，均等分成2份，其中1份放置于空氣中 4 h，另1份浸泡于復(fù)合護(hù)色液中 4 h，將2份蘋果放置于 45 ℃烘箱中烘至恒重。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取。

蛋白質(zhì)提取按照參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.2.3 蛋白質(zhì)酶解。

蛋白質(zhì)酶解按照參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

1.2.4 色譜質(zhì)譜檢測流程。

檢測用 LTQ orbitrapVelos液質(zhì)聯(lián)用儀配備戴安ultramate 3000 nano-UPLC 進(jìn)行分析，上機(jī)量 10 μL，首先進(jìn)入保護(hù)柱（C18 PepMap100，300 μm×1 mm，5 μm，100 ），隨后進(jìn)入分析柱（AcclaimPepMap C18，15 cm×75 μm，2 μm，100 ，Dionex）以流速 0.2 μL/min 進(jìn)行分析。

質(zhì)譜參數(shù)：陽離子模式，CID 碰撞模式，120 000 分辨率，質(zhì)量范圍 350～1 800，NCE 為 35%，前 top15 離子強(qiáng)度用于 MS/MS 分析。

1.3 分析方案

Orbitrap原始數(shù)據(jù)定性定量方法：對獲得的Label free蛋白質(zhì)原始數(shù)據(jù).raw，用Label free定性定量軟件maxquant（1.5.0.12）結(jié)合搜庫定性軟件Andromeda，對每個樣本進(jìn)行定性定量，參考蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為uniprot（收錄了共34 361條記錄）。具體的定性和檢索方法按照參考文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白表達(dá)分析

定性定量分析可以識別到1 797個蛋白（unique peptide≥1）。最終獲得的差異蛋白總數(shù)為909個，其中下調(diào)總數(shù)為590個，上調(diào)總數(shù)為319個[8]。

2.2 差異蛋白GO富集分析

Gene Ontology顯著性富集分析以GO term為單位，找出與基因組的所有表達(dá)基因背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的GO term。檢驗(yàn)P值，將用P≤0.05的GO term定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO term。通過GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行駛的主要生物學(xué)功能。其中BP為biological process（生物學(xué)過程）、MF為Molecular Function（分子功能）、CC為Cellular Component（細(xì)胞組件）。用GO數(shù)據(jù)庫注釋將差異蛋白，分析差異蛋白在本體論水平上的功能富集，結(jié)果顯示，差異蛋白分別在Biological process、Cellular component和Molecular function這3個水平上有顯著富集。其中差異蛋白表達(dá)數(shù)≥10的有催化活性catalytic activity（48個差異表達(dá)蛋白）、氧化還原過程oxidationreduction process（18個差異表達(dá)蛋白）、應(yīng)激反應(yīng)response to stress（17個差異表達(dá)蛋白）、碳水化合物代謝過程carbohydrate metabolic process（13個差異表達(dá)蛋白）、羧酸代謝過程carboxylic acid metabolic process（11個差異表達(dá)蛋白）、酮酸代謝過程oxoacid metabolic process（11個差異表達(dá)蛋白）、有機(jī)酸代謝過程organic acid metabolic process（11個差異表達(dá)蛋白）、非生物刺激反應(yīng)response to abiotic stimulus（10個差異表達(dá)蛋白）。通過注釋信息可知在果肉干制過程中代謝活力整體上功能集中在催化過程和氧化還原過程（表1、圖1）。

2.3 差異基因的pathway富集分析

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫，它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。KEGG的一個數(shù)據(jù)庫是GENES，另一個數(shù)據(jù)庫是LIGAND。KEGG提供的整合代謝途徑（pathway）查詢十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機(jī)物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應(yīng)的酶進(jìn)行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB庫的鏈接等。

KEGG是進(jìn)行生物體內(nèi)代謝分析、代謝網(wǎng)絡(luò)研究的強(qiáng)有力工具。

用KEGG數(shù)據(jù)庫注釋差異蛋白，分析差異蛋白在KEGG代謝通路中的富集，對差異蛋白進(jìn)行富集分析，取P<0.05為最終差異的代謝通路。結(jié)果顯示，共有2個基因通路顯著富集，在氧化磷酸化Oxidative phosphorylation中有5個蛋白參與顯著富集；在代謝通路Metabolic pathways中有11個蛋白參與顯著富集。這2個途徑與抗氧化、褐變酶合成途徑有關(guān)，說明在果片干制過程中的褐變酶與抗氧化酶蛋白可能參與褐變代謝相關(guān)酶的生成或抑制過程。這個結(jié)果與GO富集分析結(jié)果一致（表2、圖2）。

3 結(jié)論

蘋果片經(jīng)復(fù)合護(hù)色劑處理后，經(jīng)干制后取樣分析，結(jié)果表明，差異蛋白在Biological process、Cellular component和Molecular function 這3個水平上均有顯著富集。其中差異蛋白表達(dá)數(shù)≥10的有催化活性catalytic activity（48個差異表達(dá)蛋白）、氧化還原過程oxidationreduction process（18個差異表達(dá)蛋白）、應(yīng)激反應(yīng)response to stress（17個差異表達(dá)蛋白）等。KEGG分析表明，共有2個基因通路顯著富集。

參考文獻(xiàn)

[1] PERSIC M，MIKULICPETKOVSEK M，SLATNAR A，et al.Chemical composition of apple fruit，juice and pomace and the correlation between phenolic content，enzymatic activity and browning[J].LWTFood science and technology，2017，82：23-31.

[2] HEMACHANDRAN H，ANANTHARAMAN A，MOHAN S，et al.Unraveling the inhibition mechanism of cyanidin3sophoroside on polyphenol oxidase and its effect on enzymatic browning of apples[J].Food chemistry，2017，227：102-110.

[3] SUKHONTHARA S，KAEWKA K，THEERAKULKAIT C.Inhibitory effect of rice bran extracts and its phenolic compounds on polyphenol oxidase activity andbrowning in potato and apple puree[J].Food chemistry，2016，190：922-927.

[4] DU L N，SONG J，PALMER L C，et al.Quantitative proteomic changes in development of superficial scald disorder and its response to diphenylamine and 1MCP treatments in apple fruit[J].Postharvest biology and technology，2017，123：33-50.

[5] CHANG C L.Proteomic identification of a potential sex biomarker for 2 fruit fly species at pupal stage[J].Journal of Asiapacific entomology，2017，20：125-131.

[6] DAMBROSIO C，ARENA S，ROCCO M，et al.Proteomic analysis of apricot fruit during ripening[J].Journal of proteomics，2013，78：39-57.

[7] SNCHEZBEL P，EGEA I，SNCHEZBALLESTA T T，et al.Understanding the mechanisms of chilling injury in bell pepper fruits using the proteomic approach[J].Journal of proteomics，2012，75（17）：5463-5478

[8] 李新明，郭志利，李群，等.無硫復(fù)合護(hù)色劑處理的干制蘋果片中差異蛋白表達(dá)的分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（28）：71-73.