漆麗萍 馬劍 李劍美 李援龍 強(qiáng)繼業(yè)

摘要 [目的]通過(guò)香龍血樹(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)研究，建立香龍血樹(shù)再生繁殖體系。[方法]以莖段作為外植體，探索最適滅菌時(shí)間以及誘導(dǎo)培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)基最適6-BA和NAA的濃度組合。[結(jié)果]滅菌最適宜時(shí)間9 min;以MS作為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)最適的6-BA和NAA濃度組合：2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA易誘導(dǎo)長(zhǎng)出叢芽，5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA易誘導(dǎo)形成愈傷組織;以MS作為基本培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)最適6-BA和NAA濃度組合：3.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。[結(jié)論]利用帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)的外植體可迅速建立香龍血樹(shù)離體快繁體系。

關(guān)鍵詞 組織培養(yǎng);香龍血樹(shù);帶腋芽莖段;快速繁殖

中圖分類號(hào) Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）34-0071-04

龍血樹(shù)（Dracaena cambodian）屬于百合科龍血樹(shù)屬，樹(shù)葉為線狀披針形，簇生于枝條頂端，樹(shù)形極具特點(diǎn)，可塑性強(qiáng)，可以根據(jù)人的意愿塑造出不同形狀，樹(shù)干古樸滄桑，同時(shí)還能在頂部萌發(fā)新枝，給人一種沉穩(wěn)而不失朝氣的感覺(jué)，且十分耐陰，可在室內(nèi)盆栽多年仍然綠意盎然，是園林綠化及家庭盆栽的名貴樹(shù)種，具有很好的觀賞價(jià)值。同時(shí)藥用價(jià)值極高，具有止血、生肌、行氣等功效。

香龍血樹(shù)（Dracaena fragrans）是百合科龍血樹(shù)屬植物，別名也門(mén)鐵、大龍血樹(shù)、香千年木、巴西木、巴西鐵樹(shù)、山德氏龍血樹(shù)[1-4]。香龍血樹(shù)莖干挺拔，株形整齊，是重要的室內(nèi)觀葉樹(shù)種; 其小花具有濃烈的香氣，因此是良好的香味樹(shù)種;它喜光照充足、高溫、高濕環(huán)境，耐陰、耐干燥，多生長(zhǎng)于熱帶或亞熱帶地區(qū)[5]。也門(mén)鐵具有綠葉也門(mén)鐵品種，后來(lái)又相繼出現(xiàn)了金心也門(mén)鐵、金斑也門(mén)鐵和金邊也門(mén)鐵新品種，成為近年來(lái)異軍突起的時(shí)尚觀葉植物新寵[6]。香龍血樹(shù)為單莖直立灌木，葉叢生于莖頂，無(wú)柄葉長(zhǎng)寬線形，葉緣具波紋，呈深綠色，常見(jiàn)品種包括金邊香龍血樹(shù)（cv.Victoriae），葉緣深黃色帶白邊;金心香龍血樹(shù)（中斑香龍血樹(shù)）（cv.Massangeana），葉面中央具黃色縱條斑;黃邊香龍血樹(shù)（cv.Linderi），葉緣淡黃色;銀邊香龍血樹(shù) （cv.Lindeniana） ，葉片邊緣乳白色[4，7]。這些品種與上文提到的也門(mén)鐵新品種是相同變種。

2007年春，廣東大規(guī)模推廣種植的也門(mén)鐵呈現(xiàn)爆發(fā)式開(kāi)花，開(kāi)花率為80%～90%，而按照以往種植經(jīng)驗(yàn)也門(mén)鐵是很少開(kāi)花，尤其是種植3年以下的幼株鮮有開(kāi)花，由于花后死亡的傳言讓漂亮成品滯留花場(chǎng)，但也門(mén)鐵爆發(fā)式開(kāi)花涉及內(nèi)因和外因，原因尚待考證[8]。實(shí)際上香龍血樹(shù)需經(jīng)過(guò)多年才能進(jìn)入開(kāi)花期，香龍血樹(shù)室內(nèi)栽培很少開(kāi)花，觀察發(fā)現(xiàn)，香龍血樹(shù)在北方室內(nèi)栽培13年才首次開(kāi)花，香味濃烈，但開(kāi)花后不能結(jié)果[5]。香龍血樹(shù)目前多采用扦插法繁殖[ 7]。但由于香龍血樹(shù)為直立單莖灌木，分枝極少，扦插繁殖不能滿足大規(guī)模種苗需求，而組織培養(yǎng)途徑可以有效地解決市場(chǎng)種苗短缺的問(wèn)題[2]。目前關(guān)于香龍血樹(shù)組織培養(yǎng)方面的研究報(bào)道較多，組織培養(yǎng)多采用MS作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)有6-BA、IAA、IBA、KT、NAA等，通常以頂芽、嫩莖段、腋芽、葉片作為外植體進(jìn)行接種，都取得了較好的結(jié)果[2，9-13]。筆者對(duì)香龍血樹(shù)品種的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，以期建立龍血樹(shù)品種快速繁殖體系，為滿足園林綠化苗木和市場(chǎng)對(duì)藥用資源的需求并進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 香龍血樹(shù)頂芽和帶腋芽莖段取自于喜慶園林責(zé)任有限公司，取材時(shí)間是正午。

1.2 方法

1.2.1 外植體預(yù)處理。采集外植體前應(yīng)對(duì)母株或器官的生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行評(píng)估（有害微生物的滋生程度），這是滅菌的重要依據(jù)。為了減少在組織培養(yǎng)中的褐化，可以對(duì)材料進(jìn)行避光保濕（用濕潤(rùn)的毛巾包裹，裝到避光處理的容器中），然后對(duì)外植體進(jìn)行修整，切除枝條上的葉片及附屬物，用軟毛刷在流水下進(jìn)行刷洗，清洗好以后，用毛巾把水吸干，然后將外植體剪成帶2～3個(gè)節(jié)的莖段，最后再用流水沖洗。龍血樹(shù)屬于木本植物，容易褐化，所以材料需要在流水下沖洗12 h，才能徹底沖洗凈外植體表面所附帶的泥土、蟲(chóng)卵、病菌孢子。

1.2.2 外植體滅菌。對(duì)預(yù)處理的外植體用75%乙醇擦拭，然后拿到超凈工作臺(tái)上用紫外燈消毒30 min，接著用0.1%升汞消毒處理5～10 min，每種處理用20個(gè)外植體。將外植體接種于MS培養(yǎng)基中，45 d后統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、存活率，篩選龍血樹(shù)外植體最佳消毒時(shí)間。污染率指污染芽數(shù)占總接種芽數(shù)的比例;死亡率指未污染芽中死亡芽數(shù)占總接種芽數(shù)的比例;存活率指未污染芽中存活芽數(shù)占總接種芽數(shù)的比例。

1.2.3 香龍血樹(shù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。以帶腋芽莖段為外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+6-BA+NAA，6-BA設(shè)置2.0、5.0 mg/L 2個(gè)濃度，NAA設(shè)置0.20、0.50、1.00 mg/L 3個(gè)濃度。6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方見(jiàn)表 每個(gè)培養(yǎng)基處理接種20個(gè)外植體。

1.2.4 香龍血樹(shù)增殖培養(yǎng)。以誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的不定芽為外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基配方：MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+6-BA+NAA，6-BA設(shè)置2.0、3.0 mg/L 2個(gè)濃度，NAA設(shè)置0.05、0.10、0.50 mg/L 3個(gè)濃度。6種增殖培養(yǎng)基配方見(jiàn)表 每個(gè)培養(yǎng)基處理接種10個(gè)外植體。

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)條件 溫度（25±2）℃，光照時(shí)間12～14 h/d，光照強(qiáng)度1 500～3 000 lx，光質(zhì)為T(mén)4燈管發(fā)出的光。

1.4 統(tǒng)計(jì)公式 各處理均在培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果，記錄誘導(dǎo)率、出芽情況、芽增殖倍數(shù)及生長(zhǎng)狀況。誘導(dǎo)率=[形成愈傷組織的莖段數(shù)/（接種總的莖段數(shù)-污染數(shù)）]×100%;芽增殖倍數(shù)=（增殖后芽總數(shù)/增殖前芽個(gè)數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析? 數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳滅菌時(shí)間篩選 由表3可知，滅菌9 min效果最好，滅菌存活率最高，死亡數(shù)相對(duì)較低，污染率較低。

2.2 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)

由表4可知，外植體在接種45 d后，1～6號(hào)培養(yǎng)基都有愈傷組織形成（圖1），其中4號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成愈傷組織數(shù)量最多，誘導(dǎo)率為40%，其次為3號(hào)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為35%。由此可見(jiàn)，MS+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA更易誘導(dǎo)形成愈傷組織，并具有分化能力;1～6號(hào)培養(yǎng)基都誘導(dǎo)長(zhǎng)出芽（圖1），其中1號(hào)培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA）更易誘導(dǎo)長(zhǎng)芽。綜合看來(lái)初代培養(yǎng)中每種培養(yǎng)基都有較好的效果。

2.3 不定芽增殖培養(yǎng) 從表5可以看出，8號(hào)和11號(hào)培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最高為2.0，8號(hào)培養(yǎng)基不定芽有2株長(zhǎng)出根，生長(zhǎng)良好（圖2），11號(hào)培養(yǎng)基不定芽長(zhǎng)勢(shì)好，葉片綠;7號(hào)培養(yǎng)基增殖倍數(shù)為1.9，但不定芽生長(zhǎng)緩慢，有一些開(kāi)始變黃;9號(hào)和10號(hào)培養(yǎng)基增殖倍數(shù)為1.6，9號(hào)培養(yǎng)基不定芽長(zhǎng)根同時(shí)帶有紅色分泌物附著在培養(yǎng)基表面，10號(hào)培養(yǎng)基不定芽長(zhǎng)勢(shì)不明顯，有紅色分泌物附著在培養(yǎng)基表面（圖3）;12號(hào)培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最低為1.5，但不定芽長(zhǎng)勢(shì)好，葉片綠。綜合看來(lái)11號(hào)培養(yǎng)基增殖效果最好（圖4）。

3 結(jié)論與討論

組培香龍血樹(shù)用到的是長(zhǎng)了2～3個(gè)月的枝條，選用的都是解剖刀能切割下來(lái)的帶腋芽莖段，外植體滅菌過(guò)程中要根據(jù)植物的生長(zhǎng)環(huán)境以及生長(zhǎng)時(shí)間來(lái)制定滅菌時(shí)間，需嚴(yán)格執(zhí)行，探索中發(fā)現(xiàn)用升汞滅菌9 min能達(dá)到滅菌效果，誘導(dǎo)過(guò)程中存活數(shù)最高，死亡數(shù)較少，這與黃莉雅等[14]研究結(jié)果一致。

香龍血樹(shù)接種在培養(yǎng)基MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA上更容易誘導(dǎo)長(zhǎng)出叢芽，在培養(yǎng)基MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA上更容易誘導(dǎo)形成愈傷組織，形成的愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)分化能長(zhǎng)出生長(zhǎng)健壯的苗。

血竭來(lái)源于自然界中生長(zhǎng)10年以上的龍血樹(shù)，這種龍血樹(shù)受到刻傷、病害、蟲(chóng)害，才會(huì)分泌一種紅色的液體附在傷口表面，在增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，有些培養(yǎng)基表面附有一些紅色分泌物，可能是血竭。楊本鵬等[15]在海南龍血樹(shù)組織培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)行了不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及濃度對(duì)血竭形成誘導(dǎo)的研究，結(jié)果表明在含有GA3、 KT、 AD、 NAA、2，4-D和 IAA這 6 種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生紅色，只有在含 6-BA的培養(yǎng)基上才能誘導(dǎo)龍血樹(shù)無(wú)菌組培苗產(chǎn)生血竭，且誘導(dǎo)血竭與6-BA濃度無(wú)關(guān)。該試驗(yàn)中每種培養(yǎng)基均含有6-BA，但并不是所有培養(yǎng)基均能產(chǎn)生紅色分泌物，可能是由于除了6-BA外，培養(yǎng)基中還含有NAA;也可能是取材不同造成的。該研究中的香龍血樹(shù)形成“血竭”對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和濃度要求與海南龍血樹(shù)不一樣。在組培過(guò)程中生產(chǎn)出血竭是非常有意義的，能有效地推動(dòng)藥用植物在組培過(guò)程中的實(shí)踐與發(fā)展，但該試驗(yàn)中紅色分泌物是否為血竭結(jié)果還有待證實(shí)。

繼代培養(yǎng)過(guò)程中2.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA組合培養(yǎng)基上長(zhǎng)出了根，對(duì)組培苗馴化，將其移栽到自然環(huán)境中，有1株和其他香龍血樹(shù)明顯不一樣，在葉片上出現(xiàn)了金邊（圖5a），而野生型植株葉色表現(xiàn)全綠（圖5b），可能是體細(xì)胞變異，使香龍血樹(shù)表現(xiàn)型出現(xiàn)了差異，雖然市場(chǎng)上已經(jīng)有金邊香龍血樹(shù)，但該研究中的金色葉緣變異和現(xiàn)有的金邊性狀還存在很大差異，可能是一種新的變異類型。這種變異產(chǎn)生的原因是否屬于可遺傳的變異，以及后代能否100%保持這種變異還有待進(jìn)一步研究。

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