摘要：以紅顏草莓的莖尖作為外植體，研究了外植體的消毒方法、激素組合對其離體培養(yǎng)與快速繁殖的影響。結(jié)果表明，幼莖段在0.1%氯化汞+3滴吐溫-80溶液中浸泡5 min滅菌效果最好；莖尖以0.35 mm大小為宜；誘導(dǎo)叢生芽的最適培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；誘導(dǎo)試管苗生根的最適培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1 mg/L IBA。

關(guān)鍵詞：草莓；離體培養(yǎng)；不定芽；快速繁殖

中圖分類號： S668.404+.3文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）11-0066-03

收稿日期：2015-04-14

基金項目：2014年江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程（編號：SXGC[2014]141）。

作者簡介：李慧（1971—），女，江蘇宿遷人，碩士，教授，主要從事園藝作物的組織培養(yǎng)研究。E-mail：lihui710623@163.com。紅顏又稱日本99、紅頰，是日本靜岡縣用章姬與幸香雜交育成的早熟草莓栽培品種。葉片大、新莖分枝多，結(jié)果能力強，果實品質(zhì)好，果粒個大，果形、果色、價格明顯優(yōu)于豐香草莓。是春節(jié)前后集采摘、鮮食為一體的休閑旅游消費農(nóng)產(chǎn)品，深受廣大果農(nóng)和顧客的喜愛。但是，紅顏草莓苗不抗白粉病，不易育苗，幼苗一旦染病，幾天內(nèi)將全軍覆沒。因此，試管苗的繁育將有很大的市場前景。

1材料與方法

1.1材料

試驗于2014年12月至2015年4月進行。供試材料紅顏草莓苗引自淮安怡園果蔬種植專業(yè)合作社（實生苗2014年9月栽植在江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院花卉實訓(xùn)中心的無土栽培槽內(nèi)）。

1.2試驗方法

1.2.1表面滅菌試驗于晴天的下午取供試紅顏草莓剛抽出的匍匐莖的幼莖段（母株要健壯、無?。?，流水沖洗泥土、灰塵。在無菌條件下，先用75%乙醇浸泡20～30 s，無菌水沖洗3～4次，再轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞溶液+2滴吐溫-80分別浸泡8、5、4、2 min，無菌水沖洗5～8次。在以上的過程中要不斷搖動，以去除附在外植體表面的氣泡。用消毒濾紙吸干水珠后，將莖尖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整pH值至5.6～5.8。每個滅菌處理各接種50瓶，1個外植體/瓶，20 d后觀察記錄外植體的污染、死亡、無菌成活生長等情況。

1.2.2莖尖分化能力試驗取“1.2.1”節(jié)試驗最佳處理，在雙目顯微解剖鏡下剝?nèi)グ陀兹~，將莖尖接種于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基中[1]。接種外植體1個/瓶，30 d后觀察記錄莖尖分化情況。

1.2.3芽誘導(dǎo)試驗取“1.2.2”節(jié)試驗中最佳的莖尖剝制處理分別接種于以0.5 mg/L 6-BA為基礎(chǔ)的附加不同種類生長素（0.2 mg/L）配成的培養(yǎng)基、以0.2 mg/L NAA為基礎(chǔ)的附加不同種類生長素及細胞分裂素（0.5 mg/L）配成的培養(yǎng)基中[2]，每個處理各接種30瓶，1個外植體/瓶，30 d后開始調(diào)查記錄幼芽分化情況。

1.2.4繼代培養(yǎng)與擴大繁殖將長至1～2 cm的叢生芽每4～6株切成1塊，轉(zhuǎn)入不同濃度配比的6-BA和NAA配成的繼代培養(yǎng)基中。每種處理接種20瓶，4塊/瓶，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計每瓶幼苗數(shù)量，并計算出增殖率。

1.2.5根誘導(dǎo)試驗用1/2MS附加不同濃度（mg/L）IBA，有0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L及不加IBA的5個處理，接入幼苗3周后觀察記錄根的生長情況。

培養(yǎng)基均加3%蔗糖，在1.0～1.1大氣壓下熱壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度（25±2） ℃。每日光照12 h，光照度2 000 lx 。

2結(jié)果與分析

2.1不同消毒劑對紅顏幼莖滅菌的效果

在草莓組織培養(yǎng)中常用滅菌劑的種類很多。我們曾用過次氯酸鈉10%水溶液（含有效氯0.4%～0.5%），浸泡接種材料10～15 min；次氯酸鈣（漂白粉），用其飽和上清液，浸泡接種材料15～30 min；過氧化氫10%～12%水溶液，浸泡10～20 min ；新潔爾滅5%～10%水溶液，浸泡10～15 min；氯化汞0.1%水溶液，浸泡8～10 min。其中，前4種滅菌劑對接種材料比較安全，不會使活組織中毒死亡，但因滅菌時間較長，常常使接種材料的外層氧化變褐，影響培養(yǎng)效果。氯化汞有很強的殺菌能力，但浸泡時間稍長會造成接種材料中毒。即使在氯化汞處理完后，用無菌水沖洗7～8次，仍然有少量殘留在外植體上，導(dǎo)致外植體死亡。

用0.1%氯化汞溶液浸泡處理5 min，外植體染菌率為0，成活率為78%；4 min浸泡莖段，外植體總?cè)揪蕿?8%，死亡7個；當(dāng)莖段浸泡2 min后，外植體死亡數(shù)為3個，但總?cè)揪矢哌_56%（表1）。

觀察中發(fā)現(xiàn)4種處理外植體在接種1周內(nèi)都有不同程度褐化現(xiàn)象并導(dǎo)致生長緩慢，10 d后成活的外植體褐化現(xiàn)象消失（圖1、圖2）。這可能是因為使用乙醇進行表面消毒時，乙醇毒害所致。

2.2不同大小的莖尖對形態(tài)發(fā)生能力的影響

剝制后的紅顏莖尖接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7 d后開始膨大，并在外植體表面產(chǎn)生愈傷組織，20 d后部分愈傷組織上可形成幼芽。從表2可以看出，小于或等于0.1 mm的莖尖，無形態(tài)發(fā)生能力；當(dāng)莖尖達0.2 mm時，只有有限的生長；莖尖大小達0.35 mm，帶有最后1對較大的葉原基，而沒有頂端下組織時，莖尖的分化率最高；如果切取0.5 mm的莖尖，發(fā)現(xiàn)莖尖直接形成單株苗，形成愈傷組織的百分率顯著下降。

2.4不同濃度6-BA和NAA對幼苗增殖的影響

增殖培養(yǎng)基的篩選中，附加6-BA 0.5 mg/L分化反應(yīng)正常，雖然在相同的時間里新芽分化量相對較少，而長成正常幼苗的數(shù)量卻明顯較多。當(dāng)6-BA濃度超過1.0 mg/L時，新芽分化量很大，也都能長出葉片，只是葉片簇生在一起成球狀，不能長成正常幼苗（表5）。從表5可以看出，2號培養(yǎng)基對幼苗增殖的生長分化最為有利。

此外，轉(zhuǎn)苗過程中去掉原生葉片有利于新苗分化，在擴大繁殖中剔除愈傷組織，有利于新苗增殖和生長。

2.5不同濃度IBA對試管苗生根的影響

從表6可以看出，以IBA 0.1 mg/L濃度處理的生根率最高，為100%，平均根條數(shù)為2.3條。不加IBA及IBA超過02 mg/L，多數(shù)苗都是先于苗基切口處產(chǎn)生愈傷組織，隨后在愈傷組織上分化生根。當(dāng)生根苗移出栽植后，苗基的愈傷組織很快干死，使苗與根間形成了1個隔離層，成活率大大降低。

3討論

本試驗以紅顏草莓為供試材料，研究其莖尖經(jīng)脫分化后多數(shù)為愈傷組織上生根 0.50愈傷組織上生根 注：不同處理參試苗為150個，培養(yǎng)3周后統(tǒng)計結(jié)果。

誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的因子，旨在提高草莓不定芽發(fā)生率。在植物離體形態(tài)發(fā)生中，影響器官分化的因素很多，但以植物激素的調(diào)控為主[3-6]。不同植物種類，控制其不定芽發(fā)生的植物生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度以及它們之間的組合不同，本試驗中為BA與NAA的不同濃度組合。從不定芽發(fā)生的動態(tài)觀察中可知，不定芽發(fā)生高峰期集中在接種后20～40 d的時間段內(nèi)，50 d以后再生的不定芽，其芽體弱小，生長速度慢。這可能是由于隨著時間的延長，培養(yǎng)基營養(yǎng)消耗大；同時，外植體自身分泌物的積累限制了不定芽的分化及生長，也可能與愈傷組織內(nèi)某些生理生化物質(zhì)的積累有關(guān)。

參考文獻：

[1]李慧. 草莓莖尖離體培養(yǎng)研究[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004（2）：10-12.

[2]李慧，吳松，孫其文，等. 顛茄的離體培養(yǎng)與快速繁殖研究[J]. 北方園藝，2007（12）：192-194.

[3]張寧寧，夏明霞，張瓊，等. 卡特蘭組織培養(yǎng)研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：42-44.

[4]李林軒，韋瑩，黃浩，等. 紅芽大戟組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（4）：60-62.

[5]譚文澄，戴策剛. 觀賞植物組織培養(yǎng)技術(shù)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，1991.

[6]王菲彬，王斐，管玲玲，等. 植物激素對東方百合試管苗鱗片分化不定芽的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：53-55.樊琛，徐旺燁，李丹丹，等. PCR方法檢測大腸桿菌iss基因的缺陷及改進[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（11：69-70.