陳莉　趙浩然　黃琳淞　玉蘇甫江

摘要[目的]分析生物土壤結(jié)皮土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)。[方法]以生物土壤結(jié)皮土生對(duì)齒蘚為材料，分析土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，開發(fā)土生對(duì)齒蘚SSR分子標(biāo)記技術(shù)。[結(jié)果]通過MISA軟件對(duì)土生對(duì)齒蘚高通量測(cè)序獲得的73084條unigenes進(jìn)行SSR篩選。從搜索序列中發(fā)現(xiàn)4103個(gè)符合條件的SSRs，分布在3420條unigenes上，出現(xiàn)頻率為5.62%。三核苷酸和二核苷酸為主要重復(fù)類型，分別占SSR總數(shù)的47.9%和26.1%，AGC/CTG（31.9%）和AG/CT（75.5%）分別是其主要重復(fù)基元。69.0%的基序長度為12～20bp。[結(jié)論]土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率高、類型豐富、多態(tài)性潛能大，為土生對(duì)齒蘚分子生物學(xué)機(jī)制研究等方面提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 土生對(duì)齒蘚；轉(zhuǎn)錄組；SSR

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)0517-6611（2018）11-13078-03

土生對(duì)齒蘚（Didymodonvinealis）屬于土壤結(jié)皮蘚類植物，廣泛存在于干旱、半干旱地區(qū)，對(duì)于維持生物土壤結(jié)皮的穩(wěn)定，抵御風(fēng)蝕、水蝕起著關(guān)鍵作用。人們對(duì)生物土壤結(jié)皮中苔蘚的干旱適應(yīng)性形態(tài)特征和繁殖特性已有相關(guān)研究。

簡單重復(fù)序列（simplesequencerepeat，SSR）又稱微衛(wèi)星DNA（microsatdliteDNA），是由1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)單元組成，長度為10～100bp。SSR具有分布廣泛、多態(tài)性強(qiáng)、數(shù)量豐富和共顯性遺傳易于分析等特點(diǎn)，可作為較為理想的遺傳標(biāo)記。SSR標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于水稻、大麥、小麥、玉米等植物的遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多態(tài)性分析、品種鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究。

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)錄組學(xué)得到快速發(fā)展，除小立碗蘚之外，對(duì)蘚類植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)的測(cè)定鮮有報(bào)道。筆者通過高通量測(cè)序方法，從分子水平對(duì)土生對(duì)齒蘚的SSR進(jìn)行多態(tài)性研究，為進(jìn)一步探索土生對(duì)齒蘚分子生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料 供試樣品生物土壤結(jié)皮土生對(duì)齒蘚采集自騰格里沙漠東南緣寧夏中衛(wèi)市沙坡頭地區(qū)。沙坡頭地區(qū)屬草原化荒漠地帶，氣候干旱而多風(fēng)，土壤基質(zhì)為松散的流沙，沙層穩(wěn)定含水量僅2%～3%。

1.2提取ToralRNA 稱取樣品0.03g放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨成粉末狀，加入提取液振蕩混勻，具體操作參考RNApreppure植物總RNA提取試劑盒說明書。利用Nanodrop2000對(duì)所提RNA的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，Agilent2100測(cè)定RIN值。單次建庫要求RNA總量1μg，濃度≥50ng/μL，OD₂₆₀/OD₂₈₀介于1.8～2.2。

1.3RNA-seq測(cè)序流程利用帶有Oligo（dT）的磁珠與ployA進(jìn)行A-T堿基配對(duì)，可以從總RNA中分離出mR-NA，用于分析轉(zhuǎn)錄組信息。反轉(zhuǎn)合成cDNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，利用隨機(jī)引物，以mRNA為模板反轉(zhuǎn)合成一鏈cDNA，隨后進(jìn)行二鏈合成，形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。連接ada-ptor雙鏈的cDNA結(jié)構(gòu)為黏性末端，加入EndRepairMix將其補(bǔ)成平末端，隨后在3末端加上1個(gè)A堿基，用于連接Y字形的接頭，最后進(jìn)行IlluminaHiseq上機(jī)測(cè)序。

1.4土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR的篩選 采用MISA1.0軟件（hnp：//pgre.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對(duì)組裝后獲得的unigenes進(jìn)行SSR檢測(cè)，參數(shù)為單核苷酸至少重復(fù)10次；二核苷酸至少重復(fù)6次；三至六核苷酸至少重復(fù)5次。

2結(jié)果與分析

2.1土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)數(shù)量與分布頻率 由表1可知，利用MIsA軟件搜索土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組中的73084條unigenes序列，共在3420條unigenes中找到4103個(gè)符合條件的SSR8，SSR發(fā)生頻率（包含SSR的unigenes數(shù)與總uni-genes數(shù)之比）為4.68%。545條unigenes含有1個(gè)以上SSR位點(diǎn)，227條unigenes含有復(fù)合SSRs。土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組中SSR的出現(xiàn)頻率（SSR數(shù)與總unigenes數(shù)之比）為5.62%。土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SsR種類較為豐富，從重復(fù)次數(shù)看，發(fā)現(xiàn)重復(fù)基元以重復(fù)5次出現(xiàn)的頻率最高，占總SSR的29.6%；其次為6、10、7次重復(fù)，分別占總SSR的24.6%、12.9%和12.4%；而重復(fù)11次以上的基序，占比僅7.4%（表2）。

從核苷酸的基序類型來看，土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR以三核苷酸重復(fù)基序?yàn)橹饕愋?，占總SSR的47.9%；其次是二核苷酸、單核苷酸重復(fù)基序，出現(xiàn)頻率分別為26.1%和23.1%。單核苷酸重復(fù)基元以A/T占比達(dá)92.6%；二核苷酸重復(fù)類型中，以AG/CT重復(fù)基元為主，占比可達(dá)75.5%；三核苷酸重復(fù)類型中，AGC/CTG重復(fù)基元所占比例最多，達(dá)31.9%，其次是AGG/CCT和AAG/CTT，所占比例分別為14.4%和12.5%。四、五、六核苷酸重復(fù)類型中，重復(fù)基序出現(xiàn)次數(shù)普遍偏低（表3）。

2.2土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR的可用性評(píng)價(jià) 依據(jù)SSR標(biāo)記多態(tài)性可判斷其使用性能，SSR多態(tài)性受其長度影響很大。通常，當(dāng)SSR長度小于12bp時(shí)，多態(tài)性很低；當(dāng)長度為12～20bp時(shí)，多態(tài)性中等；而當(dāng)多態(tài)性大于或者等于20bp時(shí)多態(tài)性較高。該研究中，土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR長度小于12bp的有609個(gè)，占總數(shù)的15.7%；長度為12～20bp的SSR最多，達(dá)2674個(gè)，占總數(shù)的69.0%；長度為20bp以上的SSR總計(jì)593個(gè)，占總數(shù)的15.3%?？梢娡辽鷮?duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)具有較高的多態(tài)性（圖1）。

3討論

土生對(duì)齒蘚是土壤結(jié)皮植物的重要組成部分，該研究基于高通量測(cè)序拼接后得到unigenes，首次對(duì)土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行SSR位點(diǎn)信息搜索與分析。在得到的73084條unl-genes中進(jìn)行SSR搜索，共在3420條unigenes中找到了4103個(gè)符合條件的SSRs，SSR的出現(xiàn)頻率為5.62%。通過與蕨類及藻類植物比較發(fā)現(xiàn)，土生對(duì)齒蘚的出現(xiàn)頻率要比蕨類植物芒萁（Dicranopterispedata，21.03%）、鳥巢蕨（Neottopterisnidus，14.14%）、紫萁（Osmundajaponica，21.73%）、姬蕨（Hypolepisputtee，19.37%）低，但是比藻類植物大葉藻（ZosteramarinaL.，1.7%）、條斑紫菜（Porphyrayezoensis，1.53%）高。因此推測(cè)，SSR出現(xiàn)頻率具有種屬特異性。

很多植物的SSR都以三核苷酸和二核苷酸為主，但主要的重復(fù)基元不同。在該研究中，土生對(duì)齒蘚SSR中三核苷酸為主要重復(fù)類型，出現(xiàn)頻率最高，占總SSR的47.9%，二核苷酸重復(fù)類型中以AG/CT為主要重復(fù)基元。值得注意的是蕨類植物鳥巢蕨、紫萁、姬蕨的主要重復(fù)類型都是二核苷酸，且重復(fù)基元都為AG/CT，可推測(cè)AG/CT在SSR標(biāo)記中扮演著十分重要的角色。

該研究結(jié)果表明，土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR數(shù)量多、種類較為豐富，并具有較高的多態(tài)性。土生對(duì)齒蘚轉(zhuǎn)錄組SSR對(duì)于今后土生對(duì)齒蘚功能基因資源的開發(fā)利用、遺傳資源評(píng)價(jià)、豐富其分子標(biāo)記、種質(zhì)資源開發(fā)和比較基因組學(xué)研究都具有重要的價(jià)值。