張聰 樊麗博 楊會鮮 張繼穎 姚路路 周冰 張曉會

摘要?[目的]建立五加芪粉中總糖的含量測定方法，以控制五加芪粉的質量。[方法]采用苯酚-硫酸比色法，檢測波長為494 nm，以無水葡萄糖為對照品對五加芪粉中總糖的含量進行測定。[結果]無水葡萄糖對照品溶液的線性范圍為0.342～1.035 mg/mL（r=0.999 4），平均加樣回收率為98.5%，RSD=3.3%（n=6）。[結論]該研究確定的方法簡單、可靠、準確，可用于測定五加芪粉中總糖的含量。

關鍵詞?五加芪粉;總糖含量;苯酚-硫酸比色法

中圖分類號?R284.1文獻標識碼 A文章編號?0517-6611（2018）33-0147-02

五加芪粉是洛陽惠中獸藥有限公司研制開發(fā)的新型中藥免疫增強劑，已取得農業(yè)部三類新獸藥注冊證書。本品具有補中益氣、扶正祛邪的功效，用于提高禽的機體免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果。該制劑由黃芪和刺五加兩味中藥組成，研究表明黃芪多糖和刺五加多糖均具有顯著的免疫促進作用[1-3]，為本品的主要有效成分。為有效控制五加芪粉的質量，需研究并建立其多糖含量測定方法，但由于多糖組成復雜，需將其水解為單糖后再進行測定，目前多采用葡萄糖作為對照品測定樣品中多糖的相對含量。筆者建立了苯酚-硫酸比色法測定五加芪粉總糖的含量，并進行方法學考察。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?研究對象。五加芪粉，由洛陽惠中獸藥有限公司提供;D-無水葡萄糖對照品（批號110833-200904，中國食品藥品檢定研究院，99.5%）。

1.1.2?主要儀器。UV-2100型紫外-可見分光光度計，北京瑞利分析儀器公司;AB265-S型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司;恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司;HS3120型超聲波清洗器，上海楚定分析儀器有限公司。

1.1.3?主要試劑。苯酚、硫酸為分析純;水為純化水。

1.2?方法

1.2.1?對照品溶液的制備。取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成含無水葡萄糖0.6 mg/mL的溶液，即得。

1.2.2?供試品溶液的制備。取供試品50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.3?苯酚-硫酸比色法。精密量取對照品溶液與供試品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，置水浴中保溫15 min，取出，置冰水浴中冷卻3 min，加水稀釋至近刻度，再置冰水浴中冷卻3 min，取出，加水至刻度，搖勻;另量取水2.0 mL，同上平行操作作為空白對照，按照紫外-可見分光光度法，在494 nm波長處測定吸光度，按外標法以吸光度計算供試品中多糖的含量[4-5]。

1.2.4?方法學考察。

1.2.4.1?測定波長的選擇。精密量取對照品溶液與供試品溶液各2 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5 mL，搖勻，置水浴中保溫15 min，取出，置冰水浴中冷卻3 min，加水稀釋至近刻度，再置冰水浴中冷卻3 min，取出，加水至刻度，搖勻;另精密量取水2.0 mL，同上平行操作作為空白對照，按照紫外-可見分光光度法，在波長400～600 nm掃描。

1.2.4.2?線性關系考察。稱取無水葡萄糖對照品5份，分別約為15.0、22.5、30.0、40.0、50.0 mg，精密稱定，分別置于50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為0.342 3、0.437 8、0.638 8、0.833 8、1.034 8 mg/mL的對照品溶液。精密量取5個不同濃度的對照品溶液各2 mL，分別置25 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法測定。以吸光度（Y）為縱坐標、無水葡萄糖對照品溶液濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.3?精密度試驗。取“1.2.4.2”制備的0.638 8 mg/mL無水葡萄糖對照品溶液2 mL，置25 mL容量瓶中，按照“1.2.3”方法連續(xù)測定6次，測得葡萄糖吸光度，計算RSD。

1.2.4.4?重復性試驗。精密稱取同一批號的供試品（批號20120201）50 mg，按照“1.2.2”方法制備供試品溶液，平行制備6份，測定吸光度，計算總糖的平均含量和RSD。

1.2.4.5?穩(wěn)定性試驗。取同一份供試品溶液，分別于0、5、10、15、20、30 min測定吸光度，計算RSD。

1.2.4.6?加樣回收率試驗。稱取已知含量的供試品（批號20120201）25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，精密加入無水葡萄糖對照品15 mg，加水溶解并定容至刻度，搖勻，平行操作6份，按照“1.2.3”方法測定吸光度，計算平均回收率和RSD。

1.2.5?樣品的含量測定。取3批供試品，按照“1.2.2”方法制備供試品溶液并測定，計算總糖的含量。

2?結果與分析

2.1?方法學考察

2.1.1?測定波長的選擇。圖1表明，按“1.2.4.1”方法操作，對照品溶液和供試品溶液均在494 nm左右有最大吸收，故選擇494 nm作為樣品的測定波長。

2.1.2?線性關系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，以吸光度（Y）為縱坐標、無水葡萄糖對照品溶液濃度（X）為橫坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程為Y=0.792 7X-0.028 8（r=0.999 4），表明0.342～1.035 mg/mL葡萄糖濃度與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3?精密度試驗。按“1.2.4.3”方法操作，連續(xù)測定6次，測得葡萄糖吸光度RSD為0.2%，表明該方法精密度良好。

2.1.4?重復性試驗。按“1.2.4.4”方法操作，測得總糖的平均含量為619 mg/g，RSD為1.2%，表明該方法重復性良好。

2.1.5?穩(wěn)定性試驗。按“1.2.4.5”方法操作，計算吸光度的RSD為1.7%，表明供試品溶液在30 min內穩(wěn)定性良好。

2.1.6?加樣回收率試驗。按“1.2.4.6”方法操作，由表1可見，平均回收率為98.5%，RSD為3.3%，表明該方法準確可靠，可用于五加芪粉中總糖的含量測定。

2.2?含量測定?由表2可知，五加芪粉中總糖的含量為613～623 mg/g，相對偏差為0.16%～0.44%。

3?結論與討論

多糖含量的測定方法有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等，其中苯酚-硫酸法是常用測定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖等的測定，方法簡單，準確性較好，靈敏度高，適用范圍廣泛[6-7]。

黃芪為五加芪粉的君藥，黃芪多糖為黃芪提升免疫的主要有效成分，因此方法研究過程中參考了黃芪多糖注射液的含量測定方法[8]，但其供試品溶液制備方法繁瑣，而且測定過程中對照品和供試品溶液經苯酚-硫酸顯色后定容至10 mL，五加芪粉使用其方法測定結果偏差較大。該研究中的方法供試品溶液制備過程簡便，測試溶液最終定容至25 mL，平行樣品測定結果偏差較小。五加芪粉采用這2種方法測定結果一致。

該研究中的方法掃描對照品溶液和供試品溶液的最大

吸收波長均在494 nm左右，而目前苯酚-硫酸法測定多糖含量時測定波長一般為490 nm，這可能是因為供試品溶液濃度的不同導致顯色后溶液的最大吸收波長不一致，五加芪粉在490和494 nm波長條件下測定的結果一致，但494 nm波長下的靈敏度更高，因此，確定測定波長為494 nm。

該研究建立了五加芪粉中總糖含量的測定方法，方法學考察表明，該方法精密度、重復性良好，可準確測定總糖的含量，從而有效控制五加芪粉的質量。

參考文獻

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[2] 段雪磊，馬奎紅，包永占，等.刺五加免疫調節(jié)功能的研究進展[J].中獸醫(yī)學雜志，2015（6）：72-75.

[3] 李欽，胡繼宏，高博，等.黃芪多糖在免疫調節(jié)方面的最新研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（2）：199-206.

[4] 陳芬芳，蘇建青，褚秀玲.刺五加多糖含量測定方法的建立[J].畜牧與飼料科學，2014，35（9）：19-20.

[5] 張洪波，任春曉.黃芪葉提取及黃芪多糖測定方法研究[J].黑龍江醫(yī)藥，2005，18（1）：6-8.

[6] 楊莉，王志華，陶健生.黃芪中黃芪多糖含量測定方法的比較[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36（9）：562-563.

[7] 張媛媛，張彬.苯酚-硫酸法與蒽酮-硫酸法測定綠茶茶多糖的比較研究[J].食品科學，2016，37（4）：158-163.

[8] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（2015年版二部）[S].北京：中國農業(yè)出版社，2016.