李依韋 張璐璐 代玉坤

摘要?[目的]選育那西肽高產(chǎn)菌株。[方法]游動(dòng)放線菌通過紫外誘變與化學(xué)誘變，對(duì)誘變菌株進(jìn)行那西肽發(fā)酵，測(cè)定不同發(fā)酵條件下那西肽含量。[結(jié)果]對(duì)比發(fā)酵那西肽產(chǎn)量高低獲得1株發(fā)酵那西肽高產(chǎn)菌株zLL。zLL菌株在豆粉40 g/L、淀粉酶0.4 g/L、淀粉70 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基條件下，那西肽產(chǎn)量最高為1 582.73 μg/mL。與未優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基相比，提高了16.65%。[結(jié)論]該研究為今后那西肽的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞?那西肽;誘變育種;高產(chǎn)菌株

中圖分類號(hào)?R978.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）33-0080-03

那西肽（nosiheptide）是一類可以從鏈霉菌中產(chǎn)生的包含多個(gè)噻唑環(huán)的硫多肽類抗生素，屬于具有很強(qiáng)抗菌活性的硫鏈絲菌類抗生素[1]。鏈霉菌通過合成抗生素基因分析并表達(dá)自身抗性[2]。那西肽是一類非吸收型環(huán)保飼料添加劑，具有促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)、促進(jìn)營養(yǎng)吸收、增重增產(chǎn)、沒有交叉耐藥性、提高飼料利用率，且在動(dòng)物體內(nèi)低毒無殘留，對(duì)環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[3]。那西肽具有促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制乙肝病毒分泌、抗病毒和抗感染特征[4]。那西肽具有臨床藥物開發(fā)前景，但是由于那西肽水溶性差，因此目前不能應(yīng)用于臨床研究[5]。

雖然那西肽具有良好的市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益，但是由于菌種性能限制，產(chǎn)量目前不能滿足于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。高產(chǎn)菌株選育一直都是抗生素生產(chǎn)工作重點(diǎn)，誘變育種是高產(chǎn)菌株選育常用方法之一。通常對(duì)鏈霉菌采用NTG、紫外線及NTG-紫外線的聯(lián)合進(jìn)行誘變育種獲得高產(chǎn)菌株[6]。筆者對(duì)分離獲得的游動(dòng)放線菌孢子進(jìn)行紫外誘變與化學(xué)誘變，篩選得到高產(chǎn)菌株，為那西肽生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌種。游動(dòng)放線菌（內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存）。

1.1.2?培養(yǎng)基。

1.1.2.1?基本培養(yǎng)液。NaCl 0.5 g/L、KNO3 1 g/L、K2HPO4 0.5 g/L、FeSO4 0.01 g/L、可溶性淀粉20 g/L、MgSO4 0.244 g/L，pH 7.3，121 ℃高溫滅菌20 min。

1.1.2.2?種子培養(yǎng)基。葡萄糖 30 g/L、玉米漿 20 g/L、黃豆粉 20 g/L、CaCO3 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、（NH4）2SO4 3.0 g/L，pH 6.5，115 ℃高溫滅菌25 min。

1.1.2.3?發(fā)酵培養(yǎng)基。黃豆粉 35 g/L、淀粉 70 g/L、淀粉酶0.3 g/L、豆油 0.4 mL/L、（NH4）2SO4 1.5 g/L、CaCO3 5 g/L，pH 6.5，115 ℃高溫滅菌25 min。

1.1.2.4?優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。黃豆粉40 g/L、淀粉70 g/L、淀粉酶0.4 g/L、豆油0.3 mL/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5，115 ℃高溫滅菌25 min。

1.2?方法

1.2.1?制備孢子懸液。低溫保存的放線菌活化后，取生長(zhǎng)好的孢子，3 500 r/min，離心15 min，用pH 7.2的磷酸緩沖液洗滌并分散孢子。孢子液用4層無菌擦鏡紙過濾，鏡檢，獲得單孢子懸液。

1.2.2?繪制那西肽標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱量那西肽標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，0.1 mL DMF（N，N二甲基甲酰胺）溶解，加入硼酸緩沖液制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液。取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液用硼酸緩沖液、磷酸緩沖液和正丁醇稀釋，得到不同濃度的那西肽溶液，37 ℃水浴15 min。取1.5 mL上層液體與1.5 mL無水乙醇搖勻，在波長(zhǎng)408 nm處測(cè)定各濃度的吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，那西肽濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3?化學(xué)誘變。單孢子懸液1 mL，各加入1 mL磷酸緩沖液，300 μL 0.2 μg/mL的EMS（甲基磺酸乙酯）溶液，設(shè)置誘變時(shí)間為10、20、30、40、50、60 min，誘變結(jié)束后，取100 μL 0.02 mg/mL NaS2O3洗滌后離心，重復(fù)洗滌1次，用于菌種篩選，以原始孢子為對(duì)照。

1.2.4?紫外誘變。單孢子懸液1 mL，進(jìn)行紫外誘變，設(shè)置誘變時(shí)間為1、2、3、4 min，誘變后用于菌種篩選，以原始孢子為對(duì)照。

1.2.5?菌種篩選。將誘變后的孢子液移入基本培養(yǎng)液，28 ℃、200 r/min，振蕩培養(yǎng)10 h，無菌擦鏡紙過濾，除去菌絲獲得孢子液，鏡檢。取誘變后孢子液稀釋至10-3，涂布于高氏1號(hào)培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落。

挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基，28 ℃、270 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h，以接種量5%移入發(fā)酵培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)40 h，在波長(zhǎng)408 nm處測(cè)發(fā)酵液中那西肽含量。

1.2.6?那西肽產(chǎn)量的影響因素篩選。對(duì)影響發(fā)酵培養(yǎng)基的以下因素進(jìn)行篩選，即酸堿度、豆粉、淀粉、CaCO3、（NH4）2SO4、淀粉酶，調(diào)整各因素含量進(jìn)行發(fā)酵并測(cè)定那西肽含量，篩選出最佳成分含量[7-8]。

1.2.7?最佳發(fā)酵培養(yǎng)基確定。挑取zLL菌落接種于種子培養(yǎng)基，28 ℃、270 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，以接種量5%移入“1.2.6”篩選的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h，測(cè)發(fā)酵液中那西肽含量。

2?結(jié)果與分析

2.1?那西肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1中方程y=1.806 7x+0.030 0（R2=0.998 6）可知，那西肽濃度與吸光值呈良好的線性關(guān)系，可作為那西肽含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

2.2?化學(xué)誘變

由圖2可知，誘變40 min時(shí)那西肽含量最高，達(dá)903.73 μg/mL，與對(duì)照相比（那西肽含量為882.81 μg/mL）提高了2.37%。

2.3?紫外誘變

由圖3可知，誘變2 min時(shí)那西肽含量最高，達(dá)1 356.82 μg/mL，與對(duì)照相比（那西肽含量為882.81 μg/mL）提高了53.69%，獲得1株高產(chǎn)那西肽菌株zLL。

2.4?發(fā)酵的影響因素

由圖4～9可知，設(shè)置不同酸堿度時(shí)，那西肽含量不同，在pH 6.5時(shí)，那西肽產(chǎn)量最高，為1 486.53 μg/mL;豆粉含量為40 g/L時(shí)，那西肽產(chǎn)量最高，為1 484.59 μg/mL;淀粉含量為70 g/L時(shí)，那西肽產(chǎn)量最高，為1 471.83 μg/mL;CaCO3含量為4 g/L時(shí)，那西肽產(chǎn)量最高，為1 461.83 μg/mL;（NH4）2SO4含量為1.0 g/L時(shí)，那西肽產(chǎn)量最高，為1 414.87 μg/mL;淀粉酶含量為0.4 g/L時(shí)，那西肽產(chǎn)量最高，為1 417.36 μg/mL。

2.5?最佳發(fā)酵培養(yǎng)基確定

在豆粉40 g/L、淀粉酶0.4 g/L、淀粉70 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的條件下，發(fā)酵液中那西肽含量1 582.73 μg/mL，與對(duì)照那西肽含量（1 356.82 μg/mL）相比提高了16.65%。

3?結(jié)論

對(duì)保存的游動(dòng)放線菌進(jìn)行化學(xué)誘變與物理誘變，對(duì)誘變菌株發(fā)酵那西肽產(chǎn)量進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果篩選出1株高產(chǎn)菌株，在紫外誘變2 min時(shí)那西肽含量達(dá)1 356.82 μg/mL，與出發(fā)菌株相比（那西肽含量為882.81 μg/mL）提高了53.69%;對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在豆粉40 g/L、淀粉70 g/L、淀粉酶0.4 g/L、（NH4）2SO4 1.0 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 6.5的條件下，那西肽產(chǎn)量為1 582.73 μg/mL，與未優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（那西肽含量為1 356.82 μg/mL）相比提高了16.65%。

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