杜巖 郝鵬博 謝秋紅 周長(zhǎng)清 董思宏 楊蕾蕾 郭卉 任玉卓 劉志強(qiáng)

[摘要] 目的 加強(qiáng)水痘減毒活疫苗生產(chǎn)中豬源材料的外源性病毒的質(zhì)量控制，防止外源病毒污染。方法 采用酶聯(lián)免疫法對(duì)人二倍體細(xì)胞2BS株及胰蛋白酶進(jìn)行豬細(xì)小病毒檢測(cè)，并對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果 人二倍體細(xì)胞2BS株及胰蛋白酶豬細(xì)小病毒檢測(cè)結(jié)果均為陰性，且方法學(xué)驗(yàn)證中的精密度符合2010版《藥品GMP指南》的要求。結(jié)論酶聯(lián)免疫法準(zhǔn)確、快速，可用于水痘減毒活疫苗生產(chǎn)中人二倍體細(xì)胞2BS株及胰蛋白酶的外源性病毒檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 水痘減毒活疫苗；豬細(xì)小病毒；酶聯(lián)免疫法；豬源材料

[中圖分類(lèi)號(hào)] R392 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2018）03（a）-0140-02

Exogenous Detection of Porcine Materials in Vaccine Production

DU Yan， HAO Peng-bo， XIE Qiu-hong， ZHOU Chang-qing， DONG Si-hong， YANG Lei-lei， GUO Hui， REN Yu-zhuo， LIU Zhi-qiang

Quality Inspection Laboratory， Changchun Qijian Products Co.， Ltd.， Changchun， Jilin Province， 130000 China

[Abstract] Objective This paper tries to strengthen the quality control of exogenous virus of porcine source material in the production of live attenuated varicella vaccine to prevent the exogenous virus contamination. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect porcine parvovirus in human diploid cell line 2BS and trypsin. The test method was validated by methodology. Results Human diploid cell 2BS strains and trypsinized porcine parvovirus test results were negative， and the methodological validation of the precision in line with the 2010 version of “Drug GMP Guide” requirements. Conclusion Enzyme-linked immunosorbent assay is accurate and rapid and can be used to detect the exogenous virus of human diploid cell 2BS strain and trypsin in live attenuated varicella vaccine production.

[Key words] Live attenuated varicella vaccine； Porcine parvovirus； Enzyme-linked immunosorbent assay； Pig source material

如果在生產(chǎn)者建立細(xì)胞庫(kù)之前，細(xì)胞基質(zhì)在建立或傳代歷史中使用了胰酶，則所建立的主細(xì)胞庫(kù)或工作細(xì)胞庫(kù)和（或）超過(guò)生產(chǎn)限定水平的細(xì)胞至少應(yīng)檢測(cè)1次與胰酶來(lái)源動(dòng)物相關(guān)的外源性病毒包括豬細(xì)小病毒[1]，在水痘減毒活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中胰蛋白酶被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞分散階段[2]，故加強(qiáng)胰蛋白酶豬源病毒的檢測(cè)是十分必要的。該實(shí)驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫法（ELISA），對(duì)該公司用于生產(chǎn)的工作細(xì)胞庫(kù)、生產(chǎn)用對(duì)照細(xì)胞、超過(guò)生產(chǎn)限定水平的細(xì)胞及胰蛋白酶1行豬細(xì)小病毒檢測(cè)，并對(duì)此檢驗(yàn)方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[3]，先將檢測(cè)結(jié)果匯報(bào)如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

EON酶標(biāo)儀，MK3酶標(biāo)儀。

1.2 試劑與供試品

①豬細(xì)小病毒酶聯(lián)免疫分析試劑盒。②人二倍體細(xì)胞2BS株（工作細(xì)胞庫(kù)批號(hào)：2015127、生產(chǎn)用對(duì)照細(xì)胞批號(hào)：37代2015-25-1～6超過(guò)生產(chǎn)限定水平的細(xì)胞批號(hào)：38代2015-25-1～6）。③胰蛋白酶廠家Gibco批號(hào)：1629354、1664248，美國(guó)BD批號(hào)：4028465。④胰蛋白酶：精密稱(chēng)取0.25 g，用PBS稀釋成濃度為0.25%的樣品溶液。⑤人二倍體細(xì)胞2BS株：用PBS稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/mL左右。通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20 min（2 000～3 000 r/min）。仔細(xì)收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

1.3 方法

1.3.1重復(fù)性 在同一實(shí)驗(yàn)室，由同一分析人員對(duì)供試品按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，檢驗(yàn)3批供試品，每批檢驗(yàn)6次。

1.3.2 中間精密度 在同一實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備取同3批供試品按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行試驗(yàn)，每批檢驗(yàn)6次。

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)性

胰蛋白酶及人二倍體細(xì)胞2BS株各三批，每批檢驗(yàn)六次，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照均成立，供試品結(jié)果均為陰性，試驗(yàn)表明該方法重復(fù)性好，穩(wěn)定可靠。見(jiàn)表1、表2。

2.2 中間精密度

不同時(shí)間由不同分析人員使用不同設(shè)備（酶標(biāo)儀）取胰蛋白酶三批，人二倍體細(xì)胞2BS株三批分別按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢驗(yàn)，每批樣品檢驗(yàn)3次，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照均成立，供試品結(jié)果均為陰性，試驗(yàn)表明該方法中間精密度好，受隨機(jī)變動(dòng)因素影響較小。見(jiàn)表3、表4。

3 結(jié)論

目前國(guó)內(nèi)除無(wú)菌試驗(yàn)方法驗(yàn)證有法定的標(biāo)準(zhǔn)要求，其他定性方法并沒(méi)有相關(guān)法定標(biāo)準(zhǔn)，在疫苗生產(chǎn)中，豬源材料來(lái)源于動(dòng)物，對(duì)疫苗的安全性有較重要的影響，故加強(qiáng)豬源材料的質(zhì)量控制是十分必要的。

該文參考2010版《藥品GMP指南》對(duì)豬細(xì)小病毒檢測(cè)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證， 通過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證證明酶聯(lián)免疫法準(zhǔn)確、快速，可用于人二倍體細(xì)胞2BS株及胰蛋白酶的豬細(xì)小病毒檢測(cè)。水痘減毒活疫苗所采用的人二倍體細(xì)胞2BS株及胰蛋白酶通過(guò)該實(shí)驗(yàn)已證明無(wú)豬細(xì)小病毒污染，安全可靠，可用于水痘減毒活疫苗生產(chǎn)。

2015版《中國(guó)藥典》新增對(duì)細(xì)胞基質(zhì)在建立或傳代歷史中使用了胰酶，應(yīng)檢測(cè)與胰酶來(lái)源相關(guān)的外源病毒，通過(guò)該實(shí)驗(yàn)保證了該公司生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗的安全性，下一步考慮增加其他相關(guān)豬源病毒檢測(cè)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典.三部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：19-21.

[2] 趙凱，章以浩，李和民.醫(yī)學(xué)生物制品學(xué)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2007：163-165.

[3] 國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品認(rèn)證管理中心編.藥品GMP指南[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.

（收稿日期：2017-12-10）