馮瑞章，杜永華，魏琴，周萬海，何飛，黃彭，李莉

1(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

莠去津(atrazine)化學(xué)名稱為 2-氯-4-乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5- 三嗪，是一種可有效防除闊葉雜草和禾本科雜草的選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑[1]。目前已被歐盟等國家禁用，但在我國西南地區(qū)，莠去津與其他農(nóng)藥的混用品仍然作為玉米、高粱、水稻等農(nóng)作物的主要除草劑[2]。莠去津為農(nóng)業(yè)發(fā)展帶來巨大經(jīng)濟效益的同時，導(dǎo)致土壤、地表水、地下水、空氣等嚴(yán)重污染，環(huán)境和食物鏈中的莠去津?qū)θ祟惡蛣游锷诚到y(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)等有極大的不利影響，是潛在的致癌物質(zhì)[3]。目前，莠去津的礦化、生物降解已受到廣泛關(guān)注。研究表明，包括Pseudomonas(假單孢菌)、Bacillus(桿菌)、Acinetobacter(不動桿菌)、Agrobacterium(土壤桿菌)、Arthrobacter(節(jié)細菌)、Stenotrophomonas(寡養(yǎng)單胞菌)等的微生物能以莠去津為碳源、氮源及能源物質(zhì)對其進行降解[4-6]。

近年來，隨著包括莠去津等除草劑的大量使用，以植物產(chǎn)品(小麥、玉米、高粱、大米和糯米)為主要原料，以水源、大氣、生態(tài)環(huán)境條件為主要影響因子的白酒品質(zhì)受到嚴(yán)重影響，對外貿(mào)易受到嚴(yán)格限制。食品在發(fā)酵過程中，微生物對農(nóng)藥殘留具有明顯的降解作用[7-8]。課題組在前期研究中，通過對白酒糟醅進行噴施莠去津，誘導(dǎo)分離得到28株微生物菌株，本文以此為材料，篩選高效莠去津降解菌株，研究其降解莠去津的能力和性能，為莠去津降解菌的應(yīng)用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及藥劑

供試菌株為經(jīng)莠去津農(nóng)藥誘發(fā)、富集培養(yǎng)后分離自濃香型白酒糟醅的28株細菌(分離于2016年9月)，保存于宜賓學(xué)院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室。莠去津質(zhì)量分?jǐn)?shù)(99%)原藥，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

純化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，胰蛋白胨5，酵母膏5，葡萄糖10，MgSO4·7H20 0.03，CaCl2·2H2O 0.003；蒸餾水1 000 mL；pH 6.0～6.2。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO42.4，KH2PO41.2，NH4NO31，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O 0.025,Fe2(SO4)30.008；蒸餾水1 000 mL；pH 6.0～6.2。

綜上所述，我院采取綜合干預(yù)措施，使清潔手術(shù)圍手術(shù)期預(yù)防使用抗菌藥物趨于合理規(guī)范，綜合干預(yù)措施有力，成效明顯。

1.2 方法

1.2.1 莠去津降解菌株篩選及降解能力測定[6]

將28株純化、編號后的供試菌株接種于含有100 mg/L莠去津原藥的固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)代培養(yǎng)于莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，繼續(xù)轉(zhuǎn)代3次，至培養(yǎng)基中莠去津質(zhì)量濃度增至500 mg/L時還能生長的菌株，即為具有莠去津降解潛能的菌株。

將篩選到的具有莠去津降解潛能的菌株制備菌懸液(菌數(shù)約為109個/ mL)，按2%的接種量接種于50 mL莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)72 h，連同菌體轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗中，用60 mL二氯甲烷萃取3次，下層有機相經(jīng)無水硫酸鈉合并于250 mL平底燒瓶中，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(35 ℃)上減壓濃縮至近干，氮氣吹干后用色譜甲醇定容至10 mL，高效液相色譜(HPLC)測定莠去津的殘留量[9]，檢測波長220 nm，流動相V(甲醇)∶V(水)=55∶45，流速1 mL/min，進液量20 μL。

降解率%=

每株菌3次重復(fù)，以不接種為對照。

1.2.2 菌株生長動態(tài)和莠去津降解動態(tài)

將莠去津降解能力較高的菌株制備菌懸液，按2%的接種量接種于50 mL莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)，分別在0、12、24、48、72、96、120 h時取樣，測定培養(yǎng)液的OD600值和殘留的莠去津，每株菌3次重復(fù)，以不接種為對照。

1.2.3 共代謝物對菌株降解莠去津能力的影響

在50 mL莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別加入0.5%的不同碳源(檸檬酸鈉，丁二酸，葡萄糖，蔗糖)，調(diào)節(jié)pH值為6，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)72 h，測定培養(yǎng)液中殘留的莠去津，每株菌3次重復(fù)，以不加共代謝物為對照。

1.2.4 環(huán)境條件對菌株降解莠去津能力的影響

在莠去津質(zhì)量濃度為200 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過分別改變接種量(0.1%、0.5%、1%、2%、5%)、莠去津質(zhì)量濃度(25、50、100、200、500 mg/L)、培養(yǎng)溫度(20、25、30、35、40 ℃)、pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)和裝液量(25、50、75、100、125 mL)，在其他條件不變的情況下，黑暗搖床培養(yǎng)(30 ℃，160 r/min)72 h，測定培養(yǎng)液中殘留的莠去津，每株菌3次重復(fù)，以不接種為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津降解菌的篩選

對前期分離保存的28株細菌在不同濃度的莠去津平板上進行傳代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)10株菌能以莠去津為唯一碳源和能源在質(zhì)量濃度為500 mg/L的培養(yǎng)基上生存，占到總供試菌株數(shù)量的18.9%，說明這些菌株對莠去津有較高的耐受能力和降解的潛能。

通過液體培養(yǎng)對篩選到的10株菌進行液相色譜檢測和莠去津降解率的計算，由圖1可知，菌株對莠去津的降解能力存在較大差異，其中降解率大于30%的有4株菌(XQB-1、XQB-21、XQB-25、XQB-33，降解率分別為38.1%、34.6%、37.3%和41.1%)，降解率為20%～30%和小于20%的分別有4株菌(XQB-4、XQB-11、XQB-15、XQB-24)和2株菌(XQB-13、XQB-36)。在10株菌中，XQB-33的降解率最高(41.1%)，是降解率最低菌株XQB-33(13.3%)的3.1倍。為進一步挖掘莠去津降解菌的功能，選取降解率大于30%的4 株菌研究其降解性能。

圖1 菌株的莠去津降解率
Fig.1 The atrazine degradation rate of strains

2.2 菌株生長動態(tài)和莠去津降解動態(tài)

微生物可利用莠去津作為碳源、氮源，通過使底物發(fā)生脫烷基、脫N-烷基、三氮環(huán)開裂等釋放出CO2而發(fā)生徹底礦化降解[10-11]。4株菌的生長動態(tài)和莠去津降解動態(tài)結(jié)果表明(圖2)，在培養(yǎng)前期(0～24 h)，4株菌生長均較緩慢，幾乎沒有降解莠去津的能力，隨著培養(yǎng)時間的延長，菌體生長速度加快，莠去津的降解率也逐漸升高，在72 h時，4株菌的生長達到對數(shù)生長期，莠去津的降解率亦達到峰值，隨后各菌株的OD600值和降解率逐漸降低，表明4株菌的生長和功能發(fā)揮趨于同步。

圖2 菌株生長動態(tài)(A)及莠去津降解動態(tài)(B)
Fig.2 The dynamics of growth(A) and degradation rate(B) of strains

2.3 共代謝物對菌株降解莠去津能力的影響

微生物共代謝作用是農(nóng)藥發(fā)生降解的重要代謝機制[12]。由圖3可知，加入共代謝物葡糖糖和檸檬酸鈉后，4菌株的莠去津降解率均有不同程度的提高，特別是添加葡萄糖后，XQB-1的降解率由37.9%提高到53.1%，XQB-33的降解率由46.6%提高到60.7%；添加共代謝物蔗糖和丁二酸后，除XQB-1的莠去津降解率略有下降外，其他3菌株都有一定提高，表明共代謝物的添加對菌株降解莠去津的能力有一定促進作用。

圖3 共代謝物對菌株降解莠去津的影響
Fig.3 Effects of co-substrates on degradation rate of strains

2.4 環(huán)境條件對菌株降解莠去津能力的影響

將供試的4菌株通過分別改變接種量、莠去津濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH值和裝液量，在其他條件不變的情況下，培養(yǎng)72 h，測定菌株的莠去津降解率結(jié)果見圖4。

圖4 環(huán)境條件對菌株降解莠去津能力的影響
Fig.4 Effects of environmental conditions on degradation rate of strains

隨著培養(yǎng)基中接種量的增加，4株菌的莠去津降解率均呈現(xiàn)先增加，后降低的趨勢，且都在接種量為2%時莠去津降解率最高，說明2%的接種量為最適接種量(圖4-A)。可能是由于隨著接種量的增加，菌體數(shù)量增多，在培養(yǎng)前期，培養(yǎng)液能為菌體生長提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)；但是到了培養(yǎng)后期，隨著菌種的大量繁殖，培養(yǎng)液所提供的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸被消耗，抑制了菌體生長及降解酶的產(chǎn)生和莠去津的降解。

底物濃度對4菌株降解能力具有較大的影響(圖4-B)。XQB-21和XQB-25均在莠去津質(zhì)量濃度為100 mg/L時的降解率最高，分別為33.6%和35.9%，XQB-1和XQB-33則在莠去津濃度為200 mg/L時的降解率最高，分別為37.9%和46.5%，說明低濃度時，莠去津濃度增加對菌株的降解能力具有促進作用，高濃度的莠去津則對菌株的降解能力具有抑制作用。

由圖4-C可知，4菌株對莠去津的降解能力隨培養(yǎng)溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，30 ℃是4菌株的最適培養(yǎng)溫度，在20～30 ℃范圍內(nèi)，降解率隨溫度的升高而增加，在30 ℃時，4菌株的降解能力均達到最大；30 ℃后，降解率隨溫度的升高而減少，40 ℃的高溫下培養(yǎng)，XQB-21和XQB-25的培養(yǎng)液會伴有菌體沉淀產(chǎn)生，在生長量上表現(xiàn)負(fù)增長，表明這2株菌不能夠在高溫下長時間的生存。

在同一規(guī)格和型號的150 mL三角瓶中添加不同體積的培養(yǎng)基，依培養(yǎng)基體積按比例接種4株降解菌，考察裝液量對其降解率的影響(圖4-D)。在不同的裝液量下，4株菌都有一定的降解莠去津能力，說明它們均不是專性好氧或?qū)Ｐ詤捬跷⑸?。XQB-1和XQB-33在裝液量為100 mL時表現(xiàn)最高的降解率，XQB-21和XQB-25在裝液量為75 mL時表現(xiàn)最高降解率，且裝液量為125 mL時的降解率明顯高于25 mL和50 mL裝液量時的降解率，說明這些菌株對氧的敏感性不高，能夠在相對缺氧的環(huán)境中生存并發(fā)揮較強的降解莠去津能力，這可能與菌株來源有關(guān)。

培養(yǎng)基的初始pH值條件對微生物的生長和莠去津的降解有很大的影響(圖4-E)。當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為8和9時，培養(yǎng)72 h離心后發(fā)現(xiàn)基本無菌體，說明偏堿條件不適宜降解菌的生長。當(dāng)初始培養(yǎng)基pH值小于等于7時，各菌株降解莠去津的能力才有明顯增加，菌株XQB-1和XQB-21在pH值為5的培養(yǎng)基中降解率最高，分別為37.9%和34.1%，XQB- 25和XQB-33在pH值為6的條件下降解率最高，分別為35.4%和49.7%；當(dāng)pH值為3時，4菌株的降解率又較最高降解率降低了13.8%～24.38%，表明這4株菌適宜在偏酸環(huán)境生長，可能跟菌株來源于白酒糟醅的酸性環(huán)境有關(guān)。

3 討論

微生物降解是環(huán)境中殘留莠去津的主要降解方式。細菌由于其生理生化的多種適應(yīng)能力及易誘發(fā)突變菌株，在降解莠去津的微生物中占有重要地位。目前，已篩選出各類能夠礦化莠去津的降解菌，例如Nocardioidessp.DN36菌株經(jīng)過56 d可完全降解莠去津[13]，Arthrobactersp.GZK-1降解莠去津需要14 d[14]。本研究通過富集培養(yǎng)，從濃香型白酒糟醅中初篩到10株具有降解莠去津潛能的菌株，液相色譜檢測結(jié)果顯示，這些菌株的莠去津降解率為13.3%～41.4%，其中4株菌(XQB-1、XQB-21、XQB-25、XQB-33)的降解率超過30%。

4株菌的生長動態(tài)和莠去津降解動態(tài)結(jié)果表明，培養(yǎng)72 h時，4株菌的生長達到對數(shù)生長期，莠去津的降解率達到峰值，隨后菌株的OD600值和莠去津降解率均隨培養(yǎng)時間的延長而降低。微生物降解莠去津的實質(zhì)是降解酶作用下的酶促反應(yīng)過程[15]，在培養(yǎng)初期，菌株要適應(yīng)莠去津農(nóng)藥環(huán)境，并誘導(dǎo)體內(nèi)降解酶的生成，因此，菌體數(shù)量和降解率均較低；隨著菌體數(shù)量的增加，降解酶產(chǎn)生量亦逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)時間達到72 h時，菌體數(shù)量和降解酶產(chǎn)量達到最高值，降解率隨之達到峰值；培養(yǎng)后期，細菌生長變緩，菌體細胞進入衰亡期，部分被菌體細胞吸收的莠去津被逐漸釋放出來，導(dǎo)致72 h后莠去津的降解率逐漸下降。

微生物可通過生長代謝將農(nóng)藥作為碳源或氮源加以利用和分解，亦可通過共代謝方式利用其他底物獲取大部分或全部的碳源和能源，改變農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其降解[16]。加入共代謝物可以提高菌株降解莠去津的能力，特別是葡萄糖的添加可使菌株的莠去津降解率大幅升高[17]。

本研究中，供試4菌株對莠去津的最適降解條件為接種量為2%、莠去津質(zhì)量濃度100～200 mg/L、培養(yǎng)基初始pH值為5～6、培養(yǎng)溫度為30 ℃、裝液量為75～100 mL/150mL。說明微生物對莠去津的降解，除與菌株自身的屬性和莠去津的性質(zhì)外，還受環(huán)境條件如培養(yǎng)溫度、接種量、pH值等的影響[18]。

目前，雖然從環(huán)境中獲得了許多可降解莠去津的各類真菌和細菌，但對各類微生物降解過程中所涉及的中間代謝產(chǎn)物、酶及相應(yīng)的基因的研究并不深入。因此，從環(huán)境中富集分離莠去津高效降解微生物和研究其降解機理都是今后的主要研究方向。