楊娟，鐘海霞，李樹紅，白稚子，林靈，李美良，劉明宇，林昊

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625014)

半胱氨酸蛋白酶抑制因子(cysteine proteinase inhibitors，CPIs)，又稱巰基蛋白酶抑制劑，英文簡(jiǎn)稱Cystatins，是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸殘基(CySH)的蛋白酶水解作用的可逆抑制因子[1]。許多學(xué)者已從動(dòng)植物的組織和體液中分離到Cystatins蛋白，并形成了非常龐大的Cystatins超家族。Cystatins超家族根據(jù)結(jié)構(gòu)特征主要分為Stefin(家族I)、Cystatin(家族II)和Kininogen(家族III)3個(gè)家族。CPIs在生物防預(yù)[2]、免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)[3-4]、癌癥抑制[5]、細(xì)胞凋亡[6]、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移[7]以及抑菌[8-10]等生理和病理的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

目前對(duì)于陸生哺乳動(dòng)物來(lái)源的Cystatin(家族II)研究得比較透徹，但魚類來(lái)源的Cystatin(家族II)很可能具有某些特殊的性質(zhì)或活性。目前僅從部分魚組織中純化出分子質(zhì)量在12～14 ku的Cystatin，經(jīng)鑒定均存在Cystatin的保守活性位點(diǎn)[11-12]或典型抑制活性特征[13-14]。此外，盡管部分魚源Cystatin已得到克隆[15]或表達(dá)[16-17]，但研究人員尚未對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

關(guān)于Cystatin(家族II)的抑菌作用已有報(bào)道，某些陸生動(dòng)物及植物來(lái)源的Cystatin(家族II)均對(duì)不同種類的細(xì)菌[10, 18]或真菌[19-20]表現(xiàn)出明顯的抑制活性，但是關(guān)于魚類Cystatin(家族II)的抑菌作用鮮有報(bào)道，僅報(bào)道鯉魚(Cyprinuscarpio)和香魚(Plecoglossusaltivelis)的受精卵膜提取物(其中含有Cystatin抑制活性)對(duì)病原菌表現(xiàn)出抑制作用[21]。此外，本團(tuán)隊(duì)陳海[22]等人通過(guò)濾紙片法，證明鰱魚重組Cystatin(家族II)能抑制銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC27853)的生長(zhǎng)。但該蛋白對(duì)其他常見(jiàn)肉類致腐微生物的抑菌活性仍有待進(jìn)一步開展。有研究表明，動(dòng)物來(lái)源的Cystatin肽鏈結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，可能存在抑菌序列[23-25]。魚類Cystatin(家族II)肽鏈內(nèi)部是否存在類似機(jī)制，尚未見(jiàn)報(bào)道。

為此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)分析鰱魚重組Cystatin(家族II)的Papain酶解物，對(duì)草魚冷藏肉片中分離的3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果，同時(shí)結(jié)合電泳、液相、質(zhì)譜等分離鑒定方法，以期對(duì)Cystatin內(nèi)部可能含有的有效抑菌片段進(jìn)行分析和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰱魚重組Cystatin蛋白凍干粉，參照陳海等[22]的方法由本實(shí)驗(yàn)室制備，純度90.27%，比活性4 130.58 units/mg，分子質(zhì)量約為20.9 ku。

木瓜蛋白酶(Papain，P4762，10 U/mg)，美國(guó)Sigma公司，參照鐘海霞[26]的方法，Papain的純度為95.23%，比活性1.28×105units/(g·min)。

草魚冷藏肉片優(yōu)勢(shì)腐敗菌種：草莓假單胞菌(Pseudomonasfragi)、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)和中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)，參考鐘海霞[26]的方法分離篩選。

藍(lán)葡聚糖-2000、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe、細(xì)胞色素、乳鏈菌肽、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶原、γ-球蛋白，美國(guó)Sigma公司；凝膠制備試劑盒，博士德生物(武漢)有限公司；低分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(4.6～45 ku，9.5～66 ku)，美國(guó)BBI公司；IPG預(yù)制膠條pH 3～10,美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2010HT高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；SW-CJ1F無(wú)菌操作臺(tái)，佳寶進(jìn)化工程設(shè)備(蘇州)有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，一恒科學(xué)儀器(上海)有限公司；JY-ECP3000電泳儀，六一(北京)儀器廠；Mini PROTEIN 3垂直電泳槽、PROTEAN i12等電聚焦系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；Orbitrap Fusion Mass Spectrometer質(zhì)譜分析儀，美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 Papain酶解鰱魚重組Cystatin

Cystatin與Papain按1∶0.25質(zhì)量比均勻混合，加入到酶解反應(yīng)管中，并標(biāo)記為Cystatin與Papain反應(yīng)0、6、12、18、24 h的反應(yīng)管，其中0 h反應(yīng)管以水代替Papain，而對(duì)照管加入相對(duì)應(yīng)體積的Cystatin溶液，并用Cystatin代替所有對(duì)照管Papain溶液，之后加入超純水使整個(gè)反應(yīng)體系為1mL?；旌虾?7 ℃水浴。取50 μL各時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)混合物，加熱滅酶，留作小肽電泳檢測(cè)，剩余的混合液微濾除菌后用作濾紙片檢測(cè)。

1.3.2 Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)Papain酶解程度

將Papain酶解后取樣,通過(guò)小肽電泳鑒定其酶解程度。同時(shí)與Papain和蛋白原樣進(jìn)行對(duì)比，采用Tris-Tricine電泳系統(tǒng)[27]，參考SCHGGER等人[28-29]的方法制備電泳膠，利用連續(xù)Tricine-SDS-PAGE測(cè)定目的蛋白分子質(zhì)量。根據(jù)電泳圖確定Cystatin完成酶解所需的時(shí)間。

1.3.3 鰱魚重組Cystatin及其酶解物的抑菌效果比較

采用濾紙片法[30]鑒定Cystatin酶解各時(shí)間點(diǎn)的酶解物的抑菌效果，以確定酶解的最佳時(shí)間。將草莓假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和中間氣單胞菌菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600 nm≈0.6時(shí)吸取100 μL菌懸液均勻涂布于直徑為60 mm的已加入培養(yǎng)基的平板表面，貼上直徑為6 mm的無(wú)菌濾紙，向每片濾紙片上添加15、20、25、30 μL的Cystatin/Cystatin酶解物；同時(shí)以無(wú)菌水/Papain為對(duì)照。將平板于30 ℃恒溫培養(yǎng)16～18 h，觀察測(cè)定抑菌圈的大小以判斷鰱魚重組Cystatin的抑菌效果。

1.3.4 凝膠過(guò)濾高效液相色譜(TSK-GEL G2000SWXLHPLC)鑒定

參考劉玲[5]的方法鑒定待測(cè)樣品的純度和分子質(zhì)量。以標(biāo)品藍(lán)葡聚糖-2000測(cè)定TSK-GEL G2000SWXL的空體積V0，分別以Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe(0.573 ku)、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met(1.046 ku)、乳鏈菌肽(3.35 ku)、細(xì)胞色素C(13.0 ku)、胰蛋白酶(23.3 ku)、胃蛋白酶原(43.0 ku)、牛血清白蛋白(66.0 ku)、γ-球蛋白(150.0 ku)標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為標(biāo)品，相同條件下進(jìn)行色譜分析，求得各標(biāo)品的洗脫體積Ve。以Ve/V0值作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制TSK-GEL G2000SWXLHPLC的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為:y=-0.426 9x+3.399 1，R2=0.977 1。

其中色譜條件：色譜柱為TSK-GEL G2000SWXL(300 mm×7.80 mm，5 μm)，流動(dòng)相洗脫液為100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含0.1 mol/L Na2SO4和7.69 mmol/L NaN3)，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量100 μm，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.5 雙向電泳鑒定目的抑菌片段的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)

雙向電泳分為第一向等電聚焦和第二向SDS-PAGE電泳2個(gè)部分，具體操作步驟參考王任[31]的方法，以測(cè)定目的抑菌片段的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)。

1.3.6 RPLC-MS/MS串聯(lián)質(zhì)譜分析

參考劉玲[5]的方法鑒定目的抑菌片段的抑菌序列。將目的蛋白樣品進(jìn)行酶解，凍干之后的肽段用含5%ACN和0.1%FA的溶液充分溶解，離心(17 000g，15 min)后，取上清以3 μL/min流速自動(dòng)進(jìn)樣通過(guò)Eksigent 1D plus高效液相色譜系統(tǒng)，進(jìn)入C18捕捉柱，調(diào)至流速為300 μL/min洗脫至C18分析柱(100 mm×75 μm，柱料1.9 μm)。用30%A液(95%ACN和0.1%FA)洗脫20 min后線性梯度洗脫5 min至80%B液，并在80%B液處保持5 min的洗脫。洗脫的肽段通過(guò)納升電噴霧離子化進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜TripleTOF 5600(Applied Biosystem，USA)中。MS掃描范圍(m/z)350～1 250，累積時(shí)間0.25 s，MS/MS掃描范圍(m/z)100～1 500，掃描模式：HS高靈敏度模式，累積時(shí)間0.05 s，IDA采集模式，1個(gè)MS1圖譜選擇20個(gè)最強(qiáng)離子進(jìn)行串級(jí)掃描。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0數(shù)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Excel 2010計(jì)算各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用One-Way ANOVA法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tricine-SDS-PAGE鑒定酶解物

鑒定結(jié)果如圖1所示。Cystatin與Papain于37 ℃反應(yīng)0、6、12、18、24 h時(shí)，Papain都能將Cystatin徹底水解成分子質(zhì)量不同的肽段。但明確該最適酶解時(shí)間還需要結(jié)合濾紙片實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步鑒定各時(shí)段酶解物的抑菌效果。

M-Marker標(biāo)準(zhǔn)蛋白(9.5～66.0 ku); 1-Papain;2-Papain酶解鰱魚Cystatin 0 h；3-Papain酶解鰱魚Cystatin 6 h;4-Papain酶解鰱魚Cystatin 12 h; 5-Papain酶解鰱魚Cystatin 18 h;6-Papain酶解鰱魚 Cystatin 24 h
圖1 Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定酶解產(chǎn)物
Fig.1 The product was identified by Tricine-SDS-PAGE

2.2 濾紙片法鑒定Cystatin及其酶解產(chǎn)物的抑菌效果

采用濾紙片法鑒定Cystatin酶解各時(shí)間點(diǎn)的酶解物對(duì)3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌(草莓假單胞菌、腐敗希瓦氏菌和中間氣單胞菌)的抑制效果如表1所示。結(jié)果表明，Cystatin酶解0、6、12 h的酶解物對(duì)其均有抑菌效果，而Cystatin酶解18 h和24 h后的酶解物沒(méi)有抑菌活性。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cystatin及其酶解物對(duì)3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌圈直徑大小呈現(xiàn)出Cystatin 6 h酶解物>Cystatin 12 h酶解物>Cystatin原樣。結(jié)合Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果，可以確定Papain酶解Cystatin的最適條件為：Cystatin與Papain按m(Cystatin)∶m(Papain)=1∶0.25，均勻混合，37 ℃下反應(yīng)6 h，其對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑制作用見(jiàn)圖2。

表1 Cystatin不同酶解時(shí)間酶解物對(duì)腐敗菌的抑菌效果Table 1 Inhibitory effect of cystatin enzyme of differenttime dominant spoilage strains

注：“—”表示沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈。

a-草莓假單胞菌; b-腐敗希瓦氏菌; c-中間氣單胞菌;
A-Papain對(duì)照; B-Cystatin 15 μL/片; C-Cystatin 20 μL/片; D-Cystatin 25 μL/片; E-Cystatin 30 μL/片
圖2 Cystatin 6 h酶解物對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑制作用
Fig.2 Inhibitory effect of cystatin 6 h enzyme on dominant spoilage strains

實(shí)驗(yàn)中酶解后的Cystatin較Cystatin原樣對(duì)3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果強(qiáng)，可能是由于Cystatin酶解后其內(nèi)部的抑菌序列暴露出來(lái)，增強(qiáng)了抑菌效果。Cystatin酶解6 h的酶解物較Cystatin酶解12 h對(duì)3種腐敗菌的抑菌效果好，可能是因?yàn)椴煌附鈺r(shí)間Papain酶解Cystatin的產(chǎn)物不同。由此，推測(cè)實(shí)驗(yàn)所得的具有抑菌活性的片段很可能是來(lái)自Cystatin的降解物，有必要對(duì)所得的目的抑菌片段做進(jìn)一步鑒定。

2.3 目的抑菌片段的分離純化及抑菌效果

將酶解6 h后的重組Cystatin小肽片段通過(guò)TSK-GEL G2000SWXLHPLC進(jìn)行分段收集，由圖3可知，水解后的樣在TSK圖上形成了4個(gè)不同大小的峰型，其保留時(shí)間分別為13.0 min(T-1)、21.5 min(T-2)、25.0 min(T-3)、26.0 min(T-4)，分別收集各峰，于-80 ℃冷凍干燥備用。通過(guò)濾紙片法鑒定各峰的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)僅峰T-2對(duì)3種腐敗菌具有抑菌效果，其結(jié)果如圖4所示，當(dāng)Cystatin的加量為15、20、25、30 μL/片時(shí)，對(duì)草莓假單胞菌抑菌圈直徑分別為12、13、15、18 mm；對(duì)腐敗希瓦氏菌抑菌圈直徑分別為16、18、20、21 mm；對(duì)中間氣單胞菌抑菌圈直徑分別為20、22、29、33 mm。

圖3 Papain酶解重組Cystatin蛋白6 h樣上TSK-GEL G2000SWXLHPLC
Fig.3 Papain enzymatic hydrolysis of recombinant Cystatin for 6 h and identified by TSK-GEL G2000SWXLHPLC

a-草莓假單胞菌; b-腐敗希瓦氏菌; c-中間氣單胞菌;
A-Papain對(duì)照；B-Cystatin 15 μL/片；C-Cystatin 20 μL/片；D-Cystatin 25 μL/片；E-Cystatin 30 μL/片
圖4 TSK回收峰2對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effect of TSK peak 2 on dominant spoilage strains

2.4 目的抑菌片段的TSK-GEL G2000SWXLHPLC鑒定

將Cystatin酶解后經(jīng)TSK-GEL G2000SWXL分離收集的具有抑菌效果的峰T-2的凍干粉復(fù)溶后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，保留時(shí)間為21.5 min，根據(jù)峰尖處的Ve/V0值，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算其分子質(zhì)量為8.6 ku，且純度較高。

圖5 TSK gel G2000 SWXLHPLC鑒定目的抑菌片段
Fig.5 TSK gel G2000 SWXLHPLC identification bacteriostatic fragments

2.5 雙向電泳鑒定目的抑菌片段

將目的抑菌片段經(jīng)1 ku超濾杯濃縮后透析除鹽，經(jīng)雙向電泳檢測(cè)，在靠近標(biāo)準(zhǔn)10 ku附近有1條單一條帶(如圖6)，可知其分子質(zhì)量為8.6 ku，pI值為6.5，與Cystatin酶解結(jié)果基本一致。

圖6 目的抑菌片段的雙向電泳圖譜
Fig.6 2-DE Patterns of antimicrobial fragments

2.6 質(zhì)譜鑒定目的抑菌片段

質(zhì)譜產(chǎn)生的文件通過(guò)導(dǎo)入Protein Pilot 5.0 software(AB SCIEX)進(jìn)行鑒定，結(jié)果見(jiàn)表2，其質(zhì)譜圖見(jiàn)圖7。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定到3個(gè)肽片段，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)這2個(gè)肽片段序列與鰱魚Cystatin氨基酸序列(登記號(hào)：KF181446序列)完全相符，分別為31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56以及81NPSIEQVIQ89，并且其中的肽段2肽序列含有Cystatin的特征序列QVAAG，因此，說(shuō)明其有效抑菌片段來(lái)自鰱魚Cystatin本身酶解后的片段。

表2 目的抑菌片段的質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 2 Identification of bacteriostatic fragments of thetarget

注：1)得分：ProteinPilot軟件得分，>1.3即為可信；2)95%覆蓋率：可信度大于95%的肽段占整個(gè)蛋白的覆蓋率；3)95%置信區(qū)間：置信區(qū)間大于95%的肽段數(shù)，一般最好取≥2的肽鏈，1個(gè)也可接受。

a-序列: QQQVAAGMK; b-序列: QSNDAFVR; c-序列: NPSIEQVIQCK
圖7 Papain酶解Cystatin抑菌肽片段質(zhì)譜圖
Fig.7 A mass-spectrogram of Bacteriostatic Fragments of Papain enzymatic hydrolysis of recombinant Cystatin

3 討論

目前，已有大量的研究報(bào)道了重組Cystatin具有抑菌作用，如人重組Cystatin 9能抑制土拉桿菌(Francisellatulareusis)的生長(zhǎng)[8]，重組莧菜Cystatin可以抑制多種植物病原真菌[32]，以及甘蔗重組Cystatin能抑制里氏木霉(Trichodermareesei)的生長(zhǎng)[33]。而關(guān)于魚類Cystatin(家族II)的抑菌作用鮮有報(bào)道[22, 34]。

Cystatin作為一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑，其對(duì)細(xì)菌的抑制機(jī)制，主要涉及以下幾個(gè)方面。其一是通過(guò)抑制細(xì)菌分泌的胞外半胱氨酸蛋白酶(Cysteine Proteinase，CP)而發(fā)揮抑菌作用[30]。其二可能是Cystatin可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)部抑制其細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的水解活性[2]。其三可能是Cystatin的N端與CP相互作用的保守序列，能與細(xì)菌生物膜上的負(fù)電荷相結(jié)合而發(fā)揮抑菌作用[35]。其四，Cystatin內(nèi)部具有的抑菌氨基酸序列，這些抑菌片段可能干擾了微生物的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)[24]，而與Cystatin抑制CP無(wú)關(guān)[36-37]。綜上可見(jiàn)，Cystatin抑菌也可能是多種機(jī)制聯(lián)合作用的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)中，Cystatin經(jīng)適宜時(shí)間(6 h)酶解后的產(chǎn)物，相對(duì)于0、12、24 h組，對(duì)3種優(yōu)勢(shì)腐敗菌的抑菌效果最好，因此推測(cè)此時(shí)具有抑菌活性的片段很可能被完全釋放出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)鰱魚重組Cystatin酶解后分離得到分子質(zhì)量約為8.6 ku的目的抑菌肽段，而通常Cystatin(家族II)的分子質(zhì)量通常約為12～14 ku，因此判斷其為Cystatin的酶解產(chǎn)物。此外，經(jīng)質(zhì)譜鑒定到的3個(gè)肽序列，分別位于鰱魚Cystatin序列中的31QSNDAFVR38、46VQQQVAAGMKY56以及81NPSIEQVIQ89，再次證明該8.6 ku的目的抑菌肽來(lái)自于鰱魚Cystatin的酶解，即鰱魚Cystatin蛋白內(nèi)部，存在能夠發(fā)揮抑菌作用的肽片段。同時(shí)，鰱魚Cystatin的N端起始氨基酸殘基至第89個(gè)氨基酸殘基(Q89)，該片段的分子質(zhì)量為9.986 ku，這也暗示該8.6 ku片段N端可能遭到了水解破壞，其N端氨基酸并非鰱魚Cystatin的起始氨基酸，故推測(cè)其抑菌機(jī)制可能不包括通過(guò)N端序列結(jié)合菌體而發(fā)揮作用的可能性，可能是與其內(nèi)部序列有關(guān)。此外，由于該目的抑菌片段為小分子片段(8.6 ku)，因此可能更容易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部從而發(fā)揮抑制作用。鑒于Cystatin的多種抑菌機(jī)制，鰱魚重組Cystatin及其酶解產(chǎn)物對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌的具體抑菌機(jī)制，還有待進(jìn)一步深入探究。