肖凡 羅振中 盧俊 陳受琳 黃丹 周斌 陳琴琴 華福洲

南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科（南昌 330000）

膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)急性疼痛的產(chǎn)生和維持起關(guān)鍵作用。脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為參與了疼痛反應(yīng)［6］。脊髓的膠質(zhì)細(xì)胞主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。其在神經(jīng)系統(tǒng)功能中都扮演著重要作用，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［7］。近年來脊髓膠質(zhì)細(xì)胞在切口痛中的作用引起廣泛關(guān)注，外周組織損傷、手術(shù)損傷、炎癥和神經(jīng)損傷等因素都可以激活脊髓膠質(zhì)細(xì)胞。脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的激活不僅與術(shù)后機(jī)械痛敏的產(chǎn)生和維持有關(guān)，而且與異常性疼痛、痛覺過敏的產(chǎn)生和維持密切關(guān)系［1］。有研究表明抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活可以阻斷痛覺過敏狀態(tài)。圍術(shù)期使用麻醉鎮(zhèn)痛藥如氯胺酮及七氟醚等均可不同程度地抑制膠質(zhì)細(xì)胞的激活［2］。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是高選擇性α2?腎上腺素受體激動(dòng)劑，研究證實(shí)具有鎮(zhèn)痛作用［3］。然而右美托咪定對(duì)切口痛的影響及與膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)系目前仍不清楚。本研究通過建立大鼠切口痛模型，觀察右美托咪定對(duì)脊髓膠質(zhì)細(xì)胞OX42、GFAP及炎性因子表達(dá)的影響，來探討右美托咪定在切口痛中的作用，從而為減輕切口痛的發(fā)生和發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料右美托咪定（批號(hào)：H20100250，江蘇恒瑞醫(yī)藥公司），小鼠抗大鼠OX42多克隆抗體（GBP公司，美國(guó)），兔抗大鼠GFAP多克隆抗體（UCL公司，美國(guó)），Real Eevision二抗檢測(cè)系統(tǒng)（TECH公司，美國(guó)），von Frey纖維絲（Stolting公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組清潔級(jí)健康成年雄性SD大鼠，體重200～220 g，取大鼠60只，隨機(jī)分為4組（n=15）：S組為假手術(shù)組，O組為手術(shù)對(duì)照組，D1、D2組分別為低劑量及高劑量右美托咪定組。O組、D1組和D2組大鼠行左后足切開術(shù)制備切口痛模型，D1、D2組于術(shù)前10 min分別腹腔注射右美托咪定 30 μg/kg及 50 μg/kg［3］。S組和O組腹腔注射等量生理鹽水。

1.3 大鼠切口痛模型的建立大鼠后爪趾部切口疼痛模型建立：參考BRENNAN［4］的方法，在吸入1.4%異氟醚麻醉（假手術(shù)組同等麻醉）平穩(wěn)后，用碘伏消毒大鼠右后爪，在足趾面用11#刀片從距足跟0.5 cm處向足趾部作一長(zhǎng)約1 cm的縱形切口（略微旁開正中線），依次切開皮膚和筋膜，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，但保持肌肉起止和附著的完整性，輕壓止血后用5-0尼龍線縫合2針以縫合皮膚，切口局部涂抹抗生素軟膏預(yù)防感染。手術(shù)結(jié)束后置入飼養(yǎng)籠，單獨(dú)飼養(yǎng)，保持飼養(yǎng)環(huán)境一致：室溫維持在20～25℃，正常晝夜節(jié)律，無強(qiáng)光和強(qiáng)噪聲刺激，自由飲水和攝食。

1.4 術(shù)后行為學(xué)觀察于建立后爪趾部切口疼痛模型的術(shù)前（T0）、術(shù)后2、6、12、24 h（T1-4）分別觀察機(jī)械縮足反射閾值（MWT）。MWT測(cè)定：按CHAPLAN法［5］應(yīng)用von Frey纖維絲測(cè)定大鼠右后足的機(jī)械縮足反射閾值。大鼠置于底部為金屬絲網(wǎng)格的實(shí)驗(yàn)籠中，用一套應(yīng)力不同并標(biāo)有刻度的von Frey纖維絲垂直刺激大鼠右后足掌底部靠近切口的區(qū)域，維持纖維絲輕度彎曲4～6 s或在大鼠出現(xiàn)行為反應(yīng)如縮足、逃避或舔足時(shí)停止刺激。從2.0 g的纖維絲開始，最大值為15.0 g，超過此值記為15.0 g，以u(píng)p?down法推測(cè)閾值，在閾值上下各刺激5次，用內(nèi)推算法算出50%反應(yīng)閾值。每次刺激至少間隔15 s，并需等刺激引起的行為反應(yīng)完全消失后再給予下一次刺激。

1.5 Western blot行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組取3只大鼠應(yīng)用Western blot方法測(cè)定脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（OX42）和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物（GFAP）的表達(dá)水平。在吸入1.4%異氟醚麻醉平穩(wěn)后，將大鼠置于冰上，快速取出L4-6脊髓后放入2 mL凍存管中，再迅速存入液氮中。脊髓組織按照1 mL/100 mg比例加入裂解液，制成勻漿，離心取上清液，采用BSA法進(jìn)行蛋白定量。取等量樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將膜分別與一抗室溫下孵育，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫下孵育，將膜與ECL發(fā)光底物接合，膜與膠片在暗室結(jié)合曝光、顯影、成像。所得結(jié)果掃描后用進(jìn)行定量分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參照β?actin灰度值的比值表示OX42和GFAP蛋白的表達(dá)。

1.6 脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量的測(cè)定取出脊髓后，迅速冷凍、稱重，加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液手動(dòng)勻漿，4℃下離心20 min后取上清液備用。采用ELISA法測(cè)定脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量的測(cè)定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)及組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MWT值比較四組大鼠T0時(shí)MWT值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與S相比，O組大鼠T1-3時(shí)MWT值均下降（P＜0.05）；與O組相比，D1、D2組大鼠T1-3時(shí)MWT值均升高（P＜0.05）；與D1組相比，D2組大鼠T1-3時(shí)MWT值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 四組大鼠脊髓OX42及GFAP表達(dá)比較與S組相比，O組脊髓OX42表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），脊髓GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與O組相比，D1、D2組脊髓OX42的表達(dá)表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），脊髓GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.3 四組大鼠脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量比較與S組相比，O組脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量升高（P＜0.05）。與O組相比，D1、D2組脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量下降（P＜ 0.05）。見表2。

表1 四組手術(shù)前后MWT比較Tab.1 Compaerson of MWT before and after operation of four groups（n=15） x ± s，g

圖1 四組大鼠脊髓OX42及GFAP表達(dá)水平（n=6）Fig.1 Expression level of OX42 and GFAP in spinal cord for the four groups

表2 四組大鼠脊髓IL?1β、IL?6和TNF?α含量Tab.2 Levels of IL?1β，IL?6 and TNF?α in spinal cord for the four groups（n=3） x ± s，pg/mg

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠后爪趾部切口痛模型是經(jīng)典的急性疼痛模型［4］。目前認(rèn)為右美托咪定主要通過增加神經(jīng)電刺激的閾值、減慢神經(jīng)刺激的傳播和減少動(dòng)作電位的升高率來阻滯神經(jīng)刺激的產(chǎn)生和傳導(dǎo)。有研究［5］證實(shí)右美托咪定不僅可以阻斷手術(shù)時(shí)疼痛的產(chǎn)生，而且可以較長(zhǎng)時(shí)間影響機(jī)械痛敏，減少術(shù)中及術(shù)后阿片類藥物用量。本研究行為學(xué)研究結(jié)果顯示，腹腔注射右美托咪定可提高疼痛痛閾，減輕大鼠機(jī)械痛敏。

膠質(zhì)細(xì)胞激活對(duì)急性疼痛的產(chǎn)生和維持起關(guān)鍵作用。脊髓背角的膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為參與了疼痛反應(yīng)［6］。脊髓的膠質(zhì)細(xì)胞主要是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞。其在神經(jīng)系統(tǒng)功能中都扮演著重要作用，參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［7］。近年來研究［8-9］表明，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞與疼痛調(diào)制密切相關(guān)。OX42和GFAP分別是小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活的特異性標(biāo)志物［10］。在疼痛反應(yīng)中，目前認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞往往首先被激活，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞再作用于相鄰的星形膠質(zhì)細(xì)胞，可導(dǎo)致慢性痛疼反應(yīng)［11］。脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活往往發(fā)生在疼痛發(fā)展的早期階段，短暫且反復(fù)存在［12］；而星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活較晚且持久。本研究結(jié)果表明切口痛在大鼠脊髓背角OX42的表達(dá)上調(diào)，而GFAP卻沒有明顯變化，這提示急性疼痛與脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活有關(guān)；但筆者未發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，可能與本實(shí)驗(yàn)選擇的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)時(shí)間有關(guān)。LIU等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后切口痛的后期中星形膠質(zhì)細(xì)胞顯著活化，可能與研究指標(biāo)的檢測(cè)時(shí)間在術(shù)后第3天相關(guān)。腹腔注射右美托咪定30 μg/kg及50 μg/kg均可抑制急性疼痛導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，但該劑量的變化無明顯差異，提示我們的實(shí)驗(yàn)還有待改進(jìn)。

脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，其釋放大量的細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)和神經(jīng)活性物質(zhì)，如 IL?1、IL?6、TNF?α等，而這些物質(zhì)又可反作用于脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)大疼痛反應(yīng)，形成正反饋，導(dǎo)致炎癥過度反應(yīng)［14］。右美托咪定可通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，干預(yù)中樞炎癥［15］。本研究結(jié)果表明大鼠術(shù)后脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞IL?1β、IL?6和TNF?α含量明顯提高，而右美托咪定預(yù)給藥后可降低炎癥因子的分泌，提示右美托咪定可以通過抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞的激活而降低了IL?1β、IL?6和TNF?α的分泌。

綜上所述，切口痛急性期脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞參與急性疼痛的發(fā)生發(fā)展；而右美托咪定可以通過抑制脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞激活而減輕急性疼痛狀態(tài)。在急性痛模型中右美托咪定抑制脊髓膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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