張代娟 劉江月 王建英

濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室（山東濰坊261053）

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎性疾?。?］。巨噬細(xì)胞參與了AS發(fā)生發(fā)展的整個(gè)過(guò)程（脂質(zhì)條紋、斑塊形成及破裂）。活化的巨噬細(xì)胞氧化活性增強(qiáng)，釋放多種炎癥介質(zhì)，可通過(guò)胞內(nèi)炎性信號(hào)通路擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。NF?κB的活化是一個(gè)中心環(huán)節(jié)。NF?κB核易位而具有活性，調(diào)控與AS炎癥反應(yīng)相關(guān)的多種因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與AS炎癥反應(yīng)［2］。因此，從不同環(huán)節(jié)尋找抑制NF?κB活性的藥物，用于治療和預(yù)防與NF?κB有關(guān)的疾病，是當(dāng)前藥物研究的熱點(diǎn)。而挖掘祖國(guó)醫(yī)學(xué)，從中草藥及其提取物中開(kāi)發(fā)價(jià)廉、服用方便且能有效防治AS發(fā)生發(fā)展的藥物已凸顯明顯的優(yōu)勢(shì)。3，4?DHAP是從禿毛冬青葉中提取的單體成分，具有活血通脈、消腫止痛、清熱解毒等作用［3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)3，4?DHAP能抑制巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［4］，并降低兔血漿TNF?α及減少兔AS斑塊中VCAM?1的表達(dá)，具有抗炎作用［5］。但其抗炎機(jī)制尚不明確，目前國(guó)內(nèi)外研究較少。因此，本研究以NF?κB信號(hào)通路為切入點(diǎn)，以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探討3，4?DHAP抗炎的可能機(jī)制，有助于我們更全面地了解3，4?DHAP藥理機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑RAW264.7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所；3，4?DHAP（純度99.9%）日本TCI，批號(hào)：D2345?5G。LPS、Western blot相關(guān)試劑（SANTA CRUZ）；TNF?α、VCAM?1 ELISA試劑盒及一抗（武漢博士德生物工程有限公司）；IκB qRT?PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），P?IκB、IκB多克隆抗體（美國(guó)RabMAb公司）；NF?κBp65多克隆抗體（美國(guó)Abcam公司）。

1.2 主要儀器CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Forma公司）；DYCZ?25D型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Bio?Rad濕轉(zhuǎn)儀、CFX96TMReal?Time PCR 儀（美國(guó)Bio?Rad公司），凝膠成像分析儀（美國(guó)Biorad公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞。隨機(jī)分為正常組（A）、LPS組（B）、3，4?DHAP組（C）、辛伐他汀組（D）。LPS終濃度10 ng/mg，3，4?DHAP終濃度10?7mol/L，辛伐他汀終濃度10-7mol/L［6］。LPS 刺激8 h后［6］，收集細(xì)胞及上清液。

1.4 ELISA檢測(cè)TNF?α、VCAM?1的水平采用雙抗體夾心法，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 qRT?PCR檢測(cè)IκB mRNA表達(dá)收集處理后的細(xì)胞，提取總RNA，去除基因組DNA后進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以β?actin為內(nèi)參進(jìn)行RT?PCR反應(yīng)，計(jì)算目的RNA的相對(duì)表達(dá)量，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 The sequences of the primers

1.6 Western blot檢測(cè)P?IκB、IκB及NF?кB P65蛋白的表達(dá)收集處理后RAW264.7細(xì)胞，提取總蛋白，SDS?PAGE凝膠電泳分離蛋白后切取目的條帶，以濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗（1：500），4℃過(guò)夜，TBST漂洗3× 15 min，加入Ⅱ抗孵育1 h，TBST漂洗3×15 min，ECL化學(xué)發(fā)光，暗室曝光顯影，圖像分析。

1.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞核內(nèi)NF?кB P65蛋白表達(dá)參照文獻(xiàn)［7-8］報(bào)道的方法提取核蛋白，Western blot法同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF?α、VCAM?1的分泌與A組比較，B組TNF?α、VCAM?1分泌顯著增多（P＜ 0.05）；與B組比較，C、D 組TNF?α、VCAM?1分泌均顯著減少（P＜0.05），且C組較D組減少顯著（P＜0.05），說(shuō)明3，4?DHAP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF?α、VCAM?1分泌有明顯的抑制作用，且作用效果優(yōu)于辛伐他汀（圖1）。

圖1 TNF?α、VCAM?1的分泌Fig.1 The secretion of TNF?α and VCAM?1

2.2 IκB、P?IκB蛋白的表達(dá)與A組比較，B組P?IκB/IκB比值顯著增加（P＜ 0.05）；與B組比較，C、D組P?IκB/IκB比值均明顯減少（P＜ 0.05），且C組較D組減少明顯（P＜0.05），說(shuō)明3，4?DHAP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IκB蛋白磷酸化有明顯的抑制作用，且作用效果好于辛伐他汀（圖2）。

2.3 IκB mRNA的表達(dá)與A組比較，B組IκB mRNA表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與B組比較，C、D組IκB mRNA表達(dá)均明顯增加（P＜0.05），且C組較D組表達(dá)更加顯著，差異有顯著性（P＜0.05），說(shuō)明3，4?DHAP促進(jìn)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞IκB mRNA表達(dá)，且作用效果優(yōu)于辛伐他汀（圖3）。

圖3 IκB mRNA 的表達(dá)Fig.3 The expression of IκB mRNA

2.4 NF?κBp65蛋白核轉(zhuǎn)位與A組比較，B組細(xì)胞核內(nèi)NF?κB蛋白表達(dá)明顯增多（P＜0.01）；與B組比較，C、D組細(xì)胞核內(nèi)NF?κB蛋白表達(dá)均顯著減少，且C組較D組減少更為明顯，差異有顯著性（P＜0.05），說(shuō)明 3，4?DHAP抑制 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NF?κB核轉(zhuǎn)位，且作用效果優(yōu)于辛伐他汀（圖4、5）。

圖4 細(xì)胞核NF?κBp65蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of nuclear NF?κBp65 protein

3 討論

AS是眾多心腦血管疾病共同的基本病理過(guò)程，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害，尋找有效防治藥物已成為醫(yī)藥界的重要任務(wù)。巨噬細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化病變的主要細(xì)胞，是動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展的一個(gè)特征?；罨木奘杉?xì)胞釋放多種炎癥介質(zhì)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，推動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［9］。3，4?DHAP是本課題組致力研究多年的一種藥物。本研究通過(guò)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)現(xiàn)上清液中TNF?α、VCAM?1水平均明顯升高，而3，4?DHAP對(duì)TNF?α、VCAM?1分泌有明顯的抑制作用，說(shuō)明3，4?DHAP可以抑制活化的巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，這與本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn) 3，4?DHAP 具有抗炎作用的結(jié)果［4］是一致的。

圖5 細(xì)胞質(zhì)NF?κBp65蛋白表達(dá)Fig.5 The expression of cytosolic NF?κBp65 protein

研究表明，NF?κB信號(hào)通路參與慢性炎癥的反應(yīng)過(guò)程，如動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等［10］。NF?κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)多種促炎癥細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子的表達(dá)起著關(guān)鍵的調(diào)控作用［11］。例如 IL?1，6，8，TNF?α，ICAM?1，VCAM?1等，這些基因的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中存在一個(gè)或多個(gè)κB序列，因此，NF?κB的激活是這些基因活化的前提，是形成AS的前提［12］。IκB激酶是NF?κB核轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵酶，在正常細(xì)胞中，NF?κB與抑制因子IκB結(jié)合以無(wú)活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等因素刺激時(shí)，IκB磷酸化降解，NF?κB迅速?gòu)募?xì)胞漿易位到細(xì)胞核，與相應(yīng)基因的κB位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)這些基因的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白表達(dá)［13］。YU等［14］研究發(fā)現(xiàn)抑制NF?κB活性可明顯降低LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF?α、IL?1的表達(dá)。李旎等［15］研究發(fā)現(xiàn)抑制IκB磷酸化，下調(diào)NF?κB活性，能明顯減少LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TNF?α分泌。本研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞核內(nèi)NF?κB蛋白含量明顯增多，3，4?DHAP干預(yù)后，IκB蛋白表達(dá)顯著增加，細(xì)胞核內(nèi)NF?κB蛋白含量明顯減少，表明NF?κB核轉(zhuǎn)位明顯受到抑制，同時(shí)上清中TNF?α、VCAM?1水平顯著降低，表明抑制NF?κB核轉(zhuǎn)位可減輕炎癥反應(yīng)，與前人的研究結(jié)果一致。

總之，本研究證實(shí)了3，4?DHAP對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF?α、VCAM?1具有明顯的抑制作用，3，4?DHAP通過(guò)抑制NF?κB核轉(zhuǎn)位，有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

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