黃健 劉暢 陳松 閔亞麗

貴陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科（貴陽550002）

腎缺血再灌注損傷（IRI）是在腎組織缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血液灌流后腎臟功能不能得到有效恢復(fù)，甚至出現(xiàn)不可逆的腎臟功能損害，是多種腎臟疾病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。IRI的損傷機(jī)制較復(fù)雜，有多重信號(hào)通路參與調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前尚未發(fā)現(xiàn)很有效的干預(yù)措施。有研究發(fā)現(xiàn)IRI引起急性腎損傷時(shí)Wnt/β?catenin信號(hào)通路被激活，并可能參與了腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)［1］，而Wnt/β?catenin信號(hào)通路在IRI致慢性腎間質(zhì)纖維化的研究甚少。本研究觀察不同時(shí)間Wnt/β?catenin信號(hào)通路在IRI致腎小管間質(zhì)纖維化大鼠中的表達(dá)，并用β?catenin的小分子抑制劑ICG?001阻斷Wnt/β?catenin信號(hào)通路，觀察腎臟的病理變化，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立和分組選用雄性SD大鼠28只（購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），隨機(jī)分為Sham組、IRI 7 d組、IRI 14 d組、ICG+IRI組（n=7）。以5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉。IRI 7 d、IRI 14 d組及ICG+IRI組游離后用無創(chuàng)血管夾夾閉左側(cè)腎動(dòng)脈，35 min后去除血管夾，縫合傷口。Sham組游離左側(cè)腎動(dòng)脈但不夾閉。ICG+IRI組于術(shù)后第2天開始腹腔注射ICG?001［5 mg/（kg·d），上海佰世凱］。IRI 7 d組術(shù)后6 d切除右腎，術(shù)后7 d處死大鼠；其余3組大鼠術(shù)后13 d切除右腎，術(shù)后14 d處死大鼠。處死前腹主動(dòng)脈取血，分離血清。留取左腎組織部分置于4%甲醛溶液固定，部分放入-80℃低溫凍存冰箱。

1.2 腎功能測(cè)定全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清肌酐濃度。

1.3 生化染色法檢測(cè)采用天狼猩紅/快速綠色膠原染色試劑盒（Chondrex Inc）檢測(cè)膠原含量。10 μm厚冰凍切片，按試劑盒說明書操作，計(jì)算膠原量所占百分比。

1.4 腎臟組織學(xué)檢查腎組織經(jīng)10%中性緩沖甲醛過夜，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（厚度3 μm）后，Masson染色分析。

1.5 腎臟免疫組織化學(xué)采用ABC法檢測(cè)β?catenin的表達(dá)。石蠟切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2室溫孵育10 min，浸入檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)20 min，牛血清封閉20 min，加β?cateninⅠ抗（Santa Cruz）4℃孵育過夜。Ⅱ抗孵育1 h后加入ABC復(fù)合物，暗室孵育30 min，沖洗后加入顯色液，顯色10～30 min，顯微鏡下觀察，蘇木素襯染，封片。

1.6 Western blot檢測(cè)提取腎臟總蛋白并用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，每泳道30 μg蛋白，10%SDS?PAGE電泳分離后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后，分別加Tubulin（上?？党桑?∶10 000）、多克隆鼠抗β?catenin（Santa Cruz，1∶2 000）、Fibro?nectin（Santa Cruz，1∶1 000）、α?SMA（Santa Cruz，1∶10 000），Ⅰ抗4℃孵育過夜。洗膜后，再加辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色，并曝光于X光膠片上，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)分析條帶的相對(duì)吸光度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清肌酐Sham組與IRI 7 d組肌酐差異無顯著性（P＞0.05），IRI 14 d組肌酐明顯高于Sham組與IRI 7 d組（P＜0.05），ICG+IRI組血清肌酐較IRI 14 d組降低（P＜0.05），見表1。

2.2 膠原含量Sham組與IRI 7 d組膠原含量無明顯差異（P＞0.05）；與Sham組及IRI 7 d組相比，IRI 14 d組膠原含量明顯增多（P＜0.05）；ICG+IRI組與IRI 14 d組相比膠原含量明顯減少（P＜0.05）。見表1。

表1 4組大鼠血清肌酐、膠原的比較Tab.1 The comparison of serum creatinine and collagen in four groups ±s

表1 4組大鼠血清肌酐、膠原的比較Tab.1 The comparison of serum creatinine and collagen in four groups ±s

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與IRI 7 d組相比，△P＜0.05；與IRI 14 d組相比，#P＜0.05

組別Sham組IRI 7 d組IRI 14 d組ICG+IRI組Scr（mg/dL）0.352±0.085 0.437±0.059 0.897±0.058*△0.634±0.088*#膠原（%）3.843±0.620 5.028±0.852 12.014±0.921*△7.952±0.519*#

2.3 腎臟組織Masson染色觀察IRI 7 d組與Sham組相比無明顯改變（P＞0.05）；IRI 14 d組腎小管上皮細(xì)胞腫脹，間質(zhì)區(qū)增寬、部分膠原纖維沉積，少量炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化。而ICG+IRI組與IRI 14 d組相比病理改變減輕（P＜0.05）。見圖1。

2.4 β?catenin免疫組化Sham組β?catenin在腎間質(zhì)只有少量表達(dá)。IRI 7 d組與Sham組相比β?catenin表達(dá)增多（P＜0.05）。IRI 14 d與IRI 7 d組相比，β?catenin在腎間質(zhì)表達(dá)數(shù)量明顯增多（P＜0.05）。ICG+IRI組與IRI 14 d組相比，β?catenin在腎間質(zhì)表達(dá)數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。見圖2。

圖1 4組大鼠Masson病理改變（×400）Fig.1 The pathological changes in four groups（Masson Stain，× 400）

圖2 4組大鼠免疫組化比較（×400）Fig.2 The immunohistochemical expression in four groups（× 400）

2.5 Western?blot測(cè) Fibronectin、β?catenin、α?SMA的蛋白表達(dá)水平Sham組β?catenin、Fibro?nectin、α?SMA僅有微量表達(dá)。IRI 7 d組β?catenin較Sham組有所增高（P＜0.05），IRI 14 d組β?catenin較IRI 7 d組增高更加顯著（P＜0.05）。Sham組與IRI 7 d組Fibronectin、α?SMA表達(dá)無顯著差異。與Sham及IRI 7 d組相比，IRI 14 d組Fibronectin、α?SMA蛋白表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05）。與IRI 14 d組相比，ICG+IRI組β?catenin、Fibronectin及α?SMA蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠Fibronectin、β?catenin、α?SMA蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of fibronectin，β?catenin and α?SMA in four groups

3 討論

既往IRI的大部分研究集中在急性腎損傷，其致慢性腎小管間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制研究很少。較輕度的IRI會(huì)導(dǎo)致急性腎損傷，而重度的IRI則會(huì)出現(xiàn)腎間質(zhì)成肌纖維細(xì)胞激活、細(xì)胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化［2］。急性腎損傷有時(shí)可以通過適應(yīng)性修復(fù)和再生完全恢復(fù)其結(jié)構(gòu)及功能，但有時(shí)因適應(yīng)不良導(dǎo)致病情進(jìn)展成慢性腎臟?。?］。嚴(yán)重IRI所誘發(fā)的小管間質(zhì)病變會(huì)進(jìn)展為慢性小管間質(zhì)纖維化，并伴隨腎小管濃縮功能的下降和蛋白尿的發(fā)生［4］。避免腎小管間質(zhì)損傷，防止不可逆病理損害的進(jìn)展是臨床急需解決的問題，近期研究發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽、七氟醚等處理對(duì)IRI腎臟有一定保護(hù)作用［5-6］。

表2 4組大鼠β?catenin、α?SMA、Fibronectin的蛋白水平比較Tab.2 The protein assessment of β?catenin，α?SMA and fibronectin in four groups ±s

表2 4組大鼠β?catenin、α?SMA、Fibronectin的蛋白水平比較Tab.2 The protein assessment of β?catenin，α?SMA and fibronectin in four groups ±s

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與IRI 7組相比，△P＜0.05；與IRI 14組相比，#P＜0.05

組別Sham組IRI 7 d組IRI 14 d組ICG+IRI組β?catenin 0.425±0.124 0.783±0.087*1.153±0.142*△0.723±0.152*#α?SMA 0.589±0.096 0.686±0.054 1.997±0.125*△1.212±0.156*#Fibronectin 0.304±0.085 0.418±0.076 0.958±0.096*△0.627±0.088*#

盡管在正常成人腎臟是沉默狀態(tài)，但在多種腎損傷中 Wnt/β?catenin 信號(hào)通路重新激活［7-8］。近來的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β?catenin信號(hào)通路在急性腎損傷中激活可以促進(jìn)腎小管的修復(fù)及再生以保護(hù)腎臟，但其持續(xù)激活則有可能促進(jìn)急性腎損傷向慢性腎臟病的進(jìn)展［2，9］。本研究也發(fā)現(xiàn)IRI術(shù)后7 d腎間質(zhì)纖維化尚不明顯時(shí)，腎組織β?catenin即有增高，隨著時(shí)間延長，術(shù)后14 d β?catenin增高更加顯著，提示IRI致腎纖維化過程中Wnt/β?catenin信號(hào)通路激活，且早于腎間質(zhì)纖維化出現(xiàn)之前。

本研究觀察到：IRI術(shù)后14 d大鼠血肌酐明顯升高，病理改變提示腎小管間質(zhì)纖維化；Fibronec?tin、α?SMA的蛋白表達(dá)及膠原蛋白水平明顯升高。用小分子抑制劑ICG?001阻斷Wnt/β?catenin信號(hào)通路，β?catenin表達(dá)顯著減少，F(xiàn)ibronectin、α?SMA的蛋白表達(dá)水平明顯降低，膠原蛋白及血清肌酐水平也明顯下降，腎小管間質(zhì)纖維化的病理改變程度有所減輕。但在IRI所致的AKI到CKD的病程進(jìn)展中Wnt/β?catenin信號(hào)通路何時(shí)出現(xiàn)從腎臟保護(hù)作用到致病作用的轉(zhuǎn)化以及何時(shí)對(duì)該信號(hào)通路進(jìn)行干預(yù)效果最佳尚缺乏多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的連續(xù)性動(dòng)態(tài)觀察，我們?cè)诮窈蟮难芯恐袝?huì)進(jìn)一步探討。

總之，本研究觀察到在IRI致慢性腎損傷的病程中，Wnt/β?catenin信號(hào)通路早于腎間質(zhì)纖維化出現(xiàn)前就已激活，參與了慢性腎臟病的發(fā)生發(fā)展，誘導(dǎo)了腎小管間質(zhì)纖維化。而用ICG?001阻斷Wnt/β?catenin信號(hào)通路可以減輕IRI所致慢性腎間質(zhì)纖維化，為臨床上探索使用能抑制Wnt/β?catenin信號(hào)通路的藥物以防治腎缺血再灌注致慢性腎纖維化提供了理論依據(jù)。

［1］裴華穎，李英.急性缺血再灌注小鼠腎損傷修復(fù)過程中Wnt/β?catenin信號(hào)的表達(dá)［J］.中華腎臟病雜志，2011，27（1）：46?51.

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