，，，

內皮細胞在維持血管內穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用，內皮功能障礙將會導致血管收縮、白細胞黏附、膠原蛋白受損、血小板激活、血栓形成、氧化應激及血管壁的炎癥反應參與一系列心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。因此，改善內皮功能成為心血管疾病新的治療靶點。其中腎素-血管緊張素(RAS)系統(tǒng)，尤其是血管緊張素Ⅱ在內皮功能障礙的發(fā)生、發(fā)展及動脈粥樣中發(fā)揮核心作用，限制血管緊張素Ⅱ生物活性仍然是心血管疾病治療的基石[2]。因此，限制調控血管緊張素Ⅱ生成的限速酶血管緊張素轉化酶(ACE)成為改善內皮功能的關鍵。目前，血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptor blocker，ARB)已經被大量臨床研究證實能夠逆轉心血管重構、降低病死率、改善預后，但傳統(tǒng)的ACE阻斷非血管特異、組織特異、血管壁特異[3]。因此，本研究嘗試構建腺病毒載體使其攜帶有ACE基因短發(fā)夾RNA(shRNA)，然后通過下調原代培養(yǎng)大鼠血管內皮細胞(ECs)ACE的基因表達，通過ACE基因水平干預RAS系統(tǒng)表達，探索RNAi技術阻斷內血管皮細胞ACE的表達在心血管疾病基因治療領域中的應用前景。

1 材料與方法

1.1 主要材料 已經先期由本研究小組構建完成的p-ACE-sh-RNA質粒，增強的綠色熒光蛋白(EGFP)序列、人源U6啟動子，Taq DNA聚合酶、質粒pGenesil-1克隆至兩個限制性內切酶的EcoR1和Sac1之間位點。內含有大鼠ACE靶向性的 sh-RNA片段、AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)主要包括3 Cre、穿梭質粒pDC316-EGFP -shRNA-U6、p BHGlox-E1腺病毒骨架質粒與HEK- 293細胞等(北京本元正陽公司)。T4 DNA連接酶、各種限制性內切酶等。 轉染試劑Lipofectamine 2000(Gibco)、RNase A(TaKaRa)、PCR回收純化產物試劑盒(寧波中鼎公司)。質粒抽提盒(QIAGEN)，胎牛血清(Hyclone)，氯化銫(Sigma)DMEM，F(xiàn)12培養(yǎng)基(Gibco)。超絕UNIQ-10柱總RNA抽提試劑盒(上海生工生物工程公司)。其余各種試劑均為國產或進口分析純試劑。探針、引物的設計及合成由上?；瞪锛夹g工程有限公司完成。

1.2 目的基因的獲取 采用熱休克法將p-ACE-shRNA質粒取1 μL轉化入感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，接種入LB 培養(yǎng)基5 mL中，取出少部分其單克隆，在37 ℃培養(yǎng)振蕩約18 h，取3 mL菌液從中提取質粒。在HindIII限制酶和BamHI限制酶共同作用下，在37 ℃水浴酶切中過夜。酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳之后取1 μL 6×Loading Buffer與5 μL酶切產物混勻上樣后進行電泳來獲取目的基因(10 V/cm)。

1.3 pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA重組質粒的構建 酶切產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下收集質粒pDC316-EGFP-shRNA-U6的5.2 kb片段酶切產物、質粒pACE-shRNA的60 bp片段酶切產物，回收DNA片段。DNA連接酶在16 ℃水浴連接過夜，用熱休克法取連接產物5 μL轉化入DH-5α 感受態(tài)大腸桿菌，在37 ℃下培養(yǎng)振蕩18 h，之后取出菌液3 mL提取質粒，再用酶切等方法篩選出重組正確的質粒，命名為pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA。之后pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA重組質粒再進行酶切鑒定，送上海英駿生物公司進行重組質粒鑒定。

1.4 雙質粒共同轉染293細胞，同源重組而產生重組腺病毒 在轉染的前1 d，293細胞被接種至六孔板中，每孔大約有5×105個細胞，準備DMEM+10% Hyclone的胎牛血清的培養(yǎng)基，置于含有5% CO2的 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細胞生長到80%～90%底面積時，取穿梭質粒和骨架質粒進行共轉染。同時用脂質體Lipofectamine2000進行轉染，用培養(yǎng)液DMEM進行稀釋，轉染之后需要觀察出毒跡象。仔細觀察后發(fā)現(xiàn)出毒現(xiàn)象即為細胞會呈葡萄狀，變大變圓，并開始出現(xiàn)明顯的噬斑。一定要等待大部分細胞病變而且底部脫落之后再進行收毒。將其命名為Ad5-EGFP-ACE-shRNA。

1.5 將重組腺病毒Ad5-EGFP-ACE-shRNA進行PCR鑒定 293細胞被放在25 cm2的細胞瓶中培養(yǎng)，等到細胞長到底面積90%時，取上述第一代毒種(P1)接種至該細胞上，等到細胞發(fā)生完全病變時可按上述方法進行凍融細胞3次，燃后收集已經離心病毒的上清液，即為第二代的毒種(P2)。最后進行目的基因的PCR鑒定，PCR的反應條件為：55 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，共30個循環(huán)；然后72 ℃5 min。之后再進行毒種生產、純化和滴度測定。

1.6 大鼠ECs的培養(yǎng)與鑒定 首先可以在無菌條件下解剖取出大鼠胸主動脈，然后采用組織貼塊法進行血管ECs培養(yǎng)，當細胞長滿培養(yǎng)瓶底時即開始傳代，免疫熒光Ⅷ因子相關抗原檢測陽性即鑒定為ECs，實驗采用第3代～第4代的細胞。

1.7 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉染大鼠的血管ECs 當大鼠的血管ECs生長至80%～90%瓶底融合時給予傳代，無菌蓋玻片的6孔板以5×105個/孔接種放置，細胞同步化后分為空白對照組、陽性病毒組和陰性病毒組3組。在接種后24 h，細胞達60%～80%融合后進行轉染，吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，加入等量維持液，選擇對數(shù)生長期細胞，直接將病毒滴加入培養(yǎng)基中，每孔按照1∶10接種。熒光顯微鏡下觀察48 h后EGFP表達情況。分別在轉染前及轉染之后24 h、48 h、72 h收集試驗細胞。

1.8 實時熒光定量PCR檢測ACE mRNA表達 根據參試劑盒說明書來提取總的RNA，然后可以反轉錄成cDNA。在GenBank上選取大鼠的ACE mRNA序列(序列號NM_012544)，ACE探針序列為5’-FTGGCACTTGTCTGTCACTGGAGCCTGATP-3’，上游引物為5’-GCCTCCCAACGAGTTAGAAGAG-3’，下游引物為5’-CGGGACGTGGCCATTATATT-3’；β-actin探針序列為5’-FTCCAGCCTTCCTTCCTGGGTATGGAATC-3’，上游引物為5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，下游引物為5’-GGATGTCAACGTCACACTTCATG-3’；探針修飾：P代表TAQMAN-MGB基團，F(xiàn)代表FAM。首先樣品的目的基因與管家基因(β-actin)被進行PCR的擴增，之后制備標準的樣品曲線。其產物需要進行梯度稀釋用于做標準曲線。PCR的反應條件為：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸30 s，共30個循環(huán)。在GeneAmp 5700 sequence Detector System進行樣品擴增同時可以收集熒光信號，之后分析結果。為消除mRNA定量與RT及PCR反應效率的差異對結果的影響，實驗中仍然需要同步進行內對照β-actin絕對拷貝數(shù)之定量檢測，目的用以計算檢測基因與β-actin絕對拷貝數(shù)之比作為檢測基因的相對表達量。

2 結 果

2.1 pACE-shRNA質粒的酶切鑒定(見圖1) pACE-shRNA質粒經BamHI和HindIII雙酶切預期得到60bp的小片段和4.8kb兩條帶。結果與預期相符。

1代表BamHI+HindIII雙酶切pACE-shRNA質粒； M1代表DL15 000(上樣5 μL，條帶大小分別為15000、10000、7500、5000、2500、1000、250)；M2代表DL2 000(上樣5 μL，條帶大小分別為2000、1000、750、500、250、100)。

圖1 pACE-shRNA質粒的酶切鑒定電泳圖

2.2 酶切鑒定及測序鑒定 pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6重組質粒設計在質粒pDC316-EGFP-ACE-U6-shRNA中shRNA的編碼序列之后插入了一個SalI位點，所以，一條線性化條帶5.2 kb預計經SalI單酶切產生，得到的電泳結果(見圖2)與預計的相符，可以證實該重組質粒經酶切鑒定構建正確。

用引物Cdcksi-r在英駿公司進行測序比對后表明：測出的序列與U6啟動子序列完全相同。已經成功將shRNA的序列構建到重組質粒pDC316-EGFP-ACE--U6-shRNA中，因此，重組質粒pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6的構建被證實正確。

1代表SalI單酶切pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6質粒；2代表pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6質粒；M1代表DL2 000(上樣5μL，條帶大小分別為2000、1000、750、500、250 、100)；M2代表DL15 000(上樣5 μL，條帶大小分別為15 000、10 000、7 500、5 000、2 500、1 000)。

圖2重組質粒pDC316-EGFP-ACE--U6-shRNA酶切鑒定電泳圖

2.3 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒的PCR的鑒定、測序及滴度測定經鑒定Ad5-EGFP-ACE-shRNA能擴增出目的基因，大小約在500bp左右(見圖3)。

1代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6DNA原液；2代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6DNA稀釋10倍；3代表Ad5-EGFP-ACE-shRNA-U6DNA稀釋100倍；4代表陽性對照(pDC316-EGFP-ACE-shRNA-U6)；5代表陰性對照；M代表DL2 000Marker(2 000、1 000、750、500、250、100)。

圖3 PCR電泳圖

DNA測序結果同前比對表明，以位點特異性基因重組方式產生的重組腺病毒所克隆的序列和已知序列完全一致，未發(fā)現(xiàn)有移碼或突變，表明腺病毒骨架質粒和穿梭質粒發(fā)生了重組。

滴度測定結果表明：Ad5對照腺病毒的感染性滴度(TCID50/mL)為7.3×109，Ad5-EGFP-ACE-shRNA 的感染性滴度(TCID50/mL)為 8×109。

2.4 293細胞被Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉染結果 293細胞被Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉染(見圖4)，熒光顯微鏡即可觀察到轉染48 h后被轉染細胞出現(xiàn)綠色的熒光(見圖5)，表明有GFP的表達。光學顯微鏡下觀察到出現(xiàn)綠色熒光的細胞且細胞內顆粒增多、圓縮、聚集、噬斑形成突起減少，可見“葡萄串”樣形態(tài)學特征(見圖6)，有感染能力的腺病毒顆粒被證實包裝成功。

圖4轉染前的293細胞

圖5重組腺病毒轉染293細胞后48 h(熒光顯微鏡)

圖6 重組腺病毒轉染293細胞后噬斑照片(光學顯微鏡)

2.5 大鼠血管ECs的培養(yǎng)及鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見大鼠血管ECs核圓、居中、細胞邊界清晰，呈多角形，偶見雙核，單層細胞觀察到可呈鋪路石狀排列(見圖7)。對原代和傳代的細胞進行Ⅷ因子的鑒定：在熒光顯微鏡下可見細胞呈多邊形，胞漿發(fā)出綠色熒光，核圓形或橢圓形，邊界清晰，大鼠血管ECs被證實培養(yǎng)成功(見圖8)。

圖7 大鼠內皮細胞(×100)

圖8大鼠主動脈內皮細胞Ⅷ因子免疫熒光鑒定(×200)

2.6 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒轉染大鼠血管ECs之后EGFP的表達 Ad5-EGFP-ACE-shRNA重組腺病毒在轉染大鼠血管ECs 48 h后即可在熒光顯微鏡之下觀察看到病毒載體所編碼的EGFP表達，證實該病毒載體轉染細胞成功；同時可見到感染細胞可出現(xiàn)很強的凝聚性并形成細胞團，細胞的折光性增強，有時呈現(xiàn)串狀(見圖9)。轉染效率可達到95%以上。

圖9 Ad5-EGFP-ACE-shRNA
轉染大鼠血管內皮細胞后48 h(×200)

2.7 Ad5-EGFP-ACE-shRNA轉染大鼠血管ECs之后對ACE mRNA表達的影響 與空白對照組和陰性病毒組相比，轉染之后24 h陽性病毒組Ad5-EGFP-ACE-shRNA細胞的ACE mRNA表達并無明顯變化；而48 h顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；72 h時更低；表明Ad5-EGFP-ACE-shRNA可以明顯下調ACE mRNA的表達。而轉染前后各時間點空白對照組和陰性病毒組ACE mRNA表達卻無顯著變化(見表1)。結果提示RNAi所介導的基因沉默作用主要是通過靶mRNA的下調而產生的。

表1 各組細胞干預前后對ACE/β-actin mRNA表達的影響(±s)

3 討 論

全世界每年約有1 700萬人死于心血管疾病，居死亡原因首位。盡管心血管介入技術及新型藥物的研制正在迅猛發(fā)展，但目前的治療現(xiàn)狀仍然不是很滿意?？上驳氖墙┠陙韲H上對RNAi技術的研究已經取得極大進展，通過RNAi技術使致病基因沉默，成功阻斷特異性致病基因表達技術已經非常成熟，體內基因敲除技術也正在興起，該項技術已廣泛用于生命科學的多個領域，也為心血管疾病的基因治療帶來希望[4-6]。近些年來 ，國際上多位學者運用RNAi技術對心血管疾病的基因治療進行了大量研究[7-8]。我們的研究成功地構建了攜帶有ACE-shRNA基因片段的重組腺病毒載體Ad5-EGFP-ACE-shRNA，并獲得了較高的病毒滴度，成功轉染了大鼠ECs，有效地抑制了ACE mRNA 表達，證實在原代培養(yǎng)的哺乳動物細胞中RNAi技術能發(fā)揮基因下調作用，減少血管緊張素Ⅱ的生成，從而為心血管疾病ACE靶點的基因治療帶來希望，并為心血管疾病基因診斷及治療帶來新的希望。

皮細胞在維持血管穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，是多種心血管疾病發(fā)病的重要機制，改善內皮功能對多種心血管疾病均具有極大的保護效應。其中RAS系統(tǒng)，尤其是血管緊張素Ⅱ在內皮功能障礙的發(fā)生、發(fā)展及動脈粥樣中發(fā)揮核心作用，限制血管緊張素Ⅱ生物活性無疑是心血管疾病治療的基石[1-3]。因此限制調控血管緊張素Ⅱ生成的限速酶——血管緊張素轉化酶成為改善內皮功能的關鍵。目前，血管緊張素轉換酶以及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑已經被大量臨床研究證實能夠降低心血管發(fā)病率逆轉重構、改善預后、降低病死率。

動脈粥樣硬化傳統(tǒng)的危險因素包括高血壓、高脂血癥、糖尿病、肥胖、年齡、吸煙、心血管疾病家族史等，已被多位學者公認，傳統(tǒng)的危險因素只能解釋50%的動脈粥樣硬化，有學者發(fā)現(xiàn)ECs是動脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)，它可能是獨立于是AS獨立的、綜合的預測因素。然而近年來研究表明血管緊張素Ⅱ所致內皮細胞功能障礙、血管壁炎癥及氧化應激在動脈中發(fā)揮重要作用[1，9]。有研究表明，激活內皮細胞表面的血管緊張素Ⅱ會加速NO的降解，減少內皮依賴性血管擴張，從而導致動脈壁損傷，促進內皮細胞表面LDL形成ox-LDL，啟動動脈粥樣硬化[10]。血管緊張素Ⅱ促進轉錄因子NF-κB生成，NF-κB通過增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1、IL-1、IL-6生成而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生及進展[11-14]；通過刺激NADP(H)和黃嘌呤氧化酶的活性而誘導氧自由基產生，加速動脈粥樣硬化進程[15]；通過激活誘導動脈粥樣硬化斑塊纖維帽MMPs，導致纖維帽破裂從而誘發(fā)ACS[16]；本研究從基因水平阻斷ACE表達，減少血管緊張素Ⅱ的生成，理論上可以阻斷炎癥、氧化應激及基質金屬蛋白酶活動在動脈粥樣硬化中的作用，有望為冠心病ACE靶點的基因治療帶來希望。

高血壓是全世界發(fā)病率最高的疾病之一，高血壓的發(fā)病是綜合的多因素疾病，內皮功能障礙與高血壓密切相關。其中RAAS系統(tǒng)通過調節(jié)內皮細胞功能在高血壓發(fā)病中發(fā)揮極為重要的作用[17]。最近目前已經有不少學者利用miRNA技術研究了RAAS相關的miRNA對高血壓的影響。Marques等[18]發(fā)現(xiàn)遺傳性高血壓病人交感神經過度激活，miR-181a 表達降低時，腎素生成增多，血壓升高。因此miR-181a 表達水平增加時會通過抑制交感神經系統(tǒng)活性、減少腎素分泌來降低血壓； Hu等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-145過度表達會可下調ACE蛋白水平表達，導致血壓下降，但這種途徑并不會引起ACE mRNA的減少。相反激活ERK1/2 通路將會抑制 miR-145表達，上調ACE的表達水平導致血壓升高； Eskildsen等[20]體內、體外實驗均證明miR-132、miRNA-212水平和血壓水平正相關。同時發(fā)現(xiàn)miR-132、miR-212，通過激活Gαq依賴的信號轉導通路參與AngⅡ介導的高血壓的發(fā)生；最近的研究表明miR-155表達水平增高可下調ATG1RmRNA使血壓下降[21]；miR-124、miR-135a能夠抑制鹽皮質激素受體基因表達減輕前負荷使血壓下降[22-23]；上述研究均為高血壓的基因診斷及治療帶來希望，但是本研究運用RNAi技術降解ACE mRNA，下調ACE，可使血壓水平下降。且RNAi技術相比miRNA技術高效、更特異、更持久，周期短、成本低[4-6]，降壓效果及靶器官保護效應可能比上述研究更持久，目前運用RNAi技術沉默內皮細胞ACE基因的研究報道甚少，本研究有望為高血壓的基因治療提供新的思路。

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