吳思霖，王欣美，于 建，潘 晨，王 柯

(上海市食品藥品檢驗所，上海 201203)

自1996年我國農業(yè)部批準有機胂制劑在動物飼料中使用后，阿散酸(ASA)、洛克沙砷(ROX)、卡巴胂(CBS)和硝苯胂酸(NPAA)等有機胂類制劑作為飼料添加劑已廣泛應用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。由于有機砷類制劑具有刺激動物生長的作用和較廣的抗菌譜，可改善禽畜肉質、提高飼料利用率，使動物呈現(xiàn)出“皮膚紅潤、皮毛光亮”的健康假象，進而造成禽畜養(yǎng)殖業(yè)有機胂類制劑被濫用亂用的現(xiàn)狀[1-5]。然而，有機胂制劑具有一定的毒性，會影響人體內酶的活性使其失活，導致細胞代謝紊亂，進而造成中樞神經系統(tǒng)失調，腦病的發(fā)病率升高[6-7]，還可通過食物鏈危害人類健康[8]。因此開發(fā)一種可同時測定多種砷形態(tài)化合物的分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。

目前國內外常采用高效液相色譜法(HPLC)[5]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[9]、液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光法(HPLC-AFS)[10-12]、高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜(HPLC-ICP-MS)聯(lián)用[6,8,13-15]等分析砷形態(tài)化合物。HPLC-ICP-MS聯(lián)用技術因具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點，近年來已成為砷形態(tài)分析中最具應用前景的技術之一。

目前文獻中大多采用水浴加熱超聲或振蕩提取砷形態(tài)化合物，但方法耗時長(≥2 h)且易導致有機胂的損失。本研究擬采用組織研磨儀機械振蕩提取，建立一種有效分離檢測ROX等10種砷形態(tài)化合物的HPLC-ICP-MS方法，以期為相關食品的監(jiān)督檢驗提供方法參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

7700型電感耦合等離子體質譜儀、1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；1500型組織研磨儀(美國SPEX公司)；T25 Digital ULTRA TURRAX型均質儀(德國IKA公司)； 5810R 型高速離心機(德國Eppendorf 公司)；Milli-Q Advantage A10 超純水儀(美國Millipore 公司)。

ROX等10種標準物質，純度均在98%以上(Dr.Ehrenstorfer或國家標準物質中心)；甲醇(色譜純，德國Merck 公司)；正己烷(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)、碳酸銨(分析純，國藥集團)。

混合標準工作液：分別精密移取適量ROX、ASA、NPAA、CBS、砷酸(As Ⅴ)、亞砷酸(As Ⅲ)、一甲基胂酸(MMA)、 二甲基胂酸(DMA)、砷甜菜堿(As B)和砷膽堿(As C)，用水溶解稀釋配制成質量濃度為1.0 mg/L(以As 計)的混合標準溶液。

樣品：雞肉和雞肝樣品購于上海各大農貿市場、家禽店。組織樣品勻漿后于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 高效液相色譜與電感耦合等離子體質譜條件

1.2.1色譜條件色譜柱：陰離子分析柱Dionex IonPac AS 7(250 mm×4 mm)和陰離子保護柱Dionex IonPac AG7(50 mm×4 mm)；柱溫：室溫；進樣量：25 μL；流速：0.8 mL/min。流動相：A為3.85 mmol/L碳酸銨，B為300 mmol/L碳酸銨；梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，100%A；2.1～5.5 min，80%A；5.6～8.6 min，50%A；8.7～18.0 min，0%A；18.1～20.0 min，100%A。流速均為0.8 mL/min。

1.2.2質譜條件高頻等離子體發(fā)射功率：1 550 W；載氣：氬氣(99.999%)；載氣流量：0.8 L/min；載氣補償氣流量：0.4 L/min；氦反應碰撞模式；氦氣流量：4.0 mL/min；采樣錐/截取錐：Pt錐；采樣深度：8.0 mm；蠕動泵：0.4 r/min。采集質量數：砷75；積分時間：0.5 s；采集時間：1 200 s。

1.3 樣液的制備

稱取約0.5 g 勻漿后的雞肉樣品(準確至0.001 g)于50 mL 塑料離心管中，加入20 mL 10%的甲醇溶液，于組織研磨儀(1 500次/min)中機械振蕩5 min，取出后于4 ℃ 12 000 r/min 冷凍離心10 min，取10 mL上清液置于離心管中，加入10 mL 正己烷，振搖1 min后，8 000 r/min離心10 min，棄去上層正己烷。按此過程重復1 次，吸取下層清液，經0.45 μm 有機濾膜過濾后待HPLC-ICP-MS檢測。按相同操作方法做空白試驗。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

使用Agilent調諧液(Li、Y、Co、Ce 和Tl 質量濃度為1 μg/L)對儀器進行調諧，以保證儀器的最佳靈敏度和穩(wěn)定性。砷的電離能較高，難以電離，采用高電離能1 550 W以保證各種砷形態(tài)化合物能夠完全解離，同時優(yōu)化載氣流量、補償氣流量、氦氣流量及采樣深度等，以提高儀器靈敏度，并使氧化物和雙電荷的比率符合儀器推薦的要求，優(yōu)化質譜條件見“1.2.2”所述。

圖1 10種砷形態(tài)化合物混合標準溶液的HPLC-ICP-MS圖(10 μg·L-1)Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatogram of ten arsenic species(10 μg·L-1) mixed standard

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇采用Agilent SB-C18和Hamilton PRP-X100色譜柱均無法同時分離10種砷形態(tài)化合物。最終采用Dionex IonPac AS 7陰離子色譜柱，在堿性流動相系統(tǒng)下，使得砷以離子狀態(tài)存在，改善了色譜峰形，獲得了良好的分離效果(圖1)。

2.2.2流動相的選擇實驗發(fā)現(xiàn)磷酸鹽體系和甲醇-三氟乙酸體系均不能很好地分離10種砷形態(tài)化合物，而高濃度的碳酸銨溶液有利于ROX、NPAA、CBS、As Ⅴ盡快洗脫。實驗最終確定以3.85 mmol/L 碳酸銨溶液和300 mmol/L 碳酸銨溶液作為流動相，采用梯度洗脫的方式可在20 min 內實現(xiàn)10種砷形態(tài)的良好分離，且峰形尖銳，分離度良好。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1取樣量的優(yōu)化分別考察了取樣量為0.5、1.0、2.0 g時10種砷形態(tài)化合物的回收率。結果表明，取樣量僅對As Ⅲ的提取有較大影響，取樣量越少，As Ⅲ的提取回收率越高。當取樣量為0.5 g時，10種砷形態(tài)化合物的提取率均大于80%，因此，確定本方法的取樣量為0.5 g。

2.3.2提取溶劑的考察分別考察了5%、10%、25%、50%的甲醇溶液對雞肉及雞肝樣品中10種砷形態(tài)化合物的提取效率。結果表明，當甲醇含量為50%時，高濃度的有機試劑易導致離子源不穩(wěn)定，甚至熄滅，且有機物分解形成的碳易導致 ICP-MS 錐口堵塞，噪聲提高。當甲醇含量為10%和25%時均可有效提取樣品中的有機胂，且含水比例高可顯著提高無機砷(As Ⅲ和As Ⅴ)的提取效率。當甲醇含量為5%時，無機砷的提取效率高，但有機胂(如ROX等)不能提取完全。因此，最終選用10%的甲醇溶液作為提取溶劑，此時，10種砷形態(tài)化合物的提取率均大于80%。

2.3.3提取及凈化方式的考察分別考察了均質提取、恒溫水浴振蕩提取以及微波輔助萃取3種提取方式對10種砷形態(tài)化合物的提取回收率，結果均不理想(表1)。而采用組織研磨儀高速振蕩5 min可成功提取10種砷形態(tài)化合物，該法省時、簡便、高效，且不易造成樣品的污染和損失，10種砷形態(tài)化合物的提取率均大于80%。采用甲醇溶液提取、正己烷萃取，可有效去除樣品基質中的蛋白質和油脂，所得溶液再經0.45 μm有機濾膜過濾去除大顆粒雜質以起到多重凈化的作用。

表1 10種砷形態(tài)化合物的提取回收率Table 1 Extraction recoveries of ten arsenic species R/%

2.4 方法線性范圍及檢出限

取10種砷的混合標準工作液(1.0 mg/L)用水稀釋成 0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的混合標準工作溶液，以質量濃度(x，μg/L)為橫坐標，各組分的響應值(y)為縱坐標，在優(yōu)化條件下進行測定，繪制標準曲線。結果表明，10種砷形態(tài)化合物在0.1～100 μg/L質量濃度范圍內線性良好，相關系數(r2)均大于0.999，標準曲線回歸方程見表2。以HPLC-ICP-MS 色譜峰信噪比(S/N)為3時所對應的濃度計算檢出限(LOD)，以S/N為10時所對應的濃度計算定量下限(LOQ)，在進樣量為25 μL 時，10種砷形態(tài)化合物的檢出限為0.3～1.5 μg/kg，定量下限為1.0～5.0 μg/kg(以As計，表2)。

表2 10種砷形態(tài)化合物的線性方程、相關系數(r2)、檢出限及定量下限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(r2) ,detection limits and quantitation limits of ten arsenic species

2.5 加標回收率及精密度

選用一系列空白樣品，分別添加10種砷的混合標準溶液，使添加水平為1、10、50 μg/kg，其余按“1.3”方法操作，分析測定并計算其回收率和精密度，測得3個加標水平下的平均回收率為81.3%～97.7%，相對標準偏差(RSD，n=6)為0.1%～3.5%。

2.6 實際樣品的檢測

按照上述方法對雞肉和雞肝等30批次樣品進行測定，除1批雞肝樣品檢出ASA(3.4 μg/kg)和As Ⅲ(2.7 μg/kg)外，其余樣品均呈陰性。表明方法可用于實際樣品的測定。

3 結 論

本研究建立了HPLC-ICP-MS同時測定雞肉和雞肝中ROX、ASA、NPAA、CBS、As Ⅴ、As Ⅲ、MMA、DMA、As B 和 As C共10種砷形態(tài)化合物的分析方法。樣品前處理簡單，回收率穩(wěn)定，靈敏度高，適用于雞肉及雞肝樣品中10種砷形態(tài)化合物的定性定量分析，對排查和保證食品安全具有重要的現(xiàn)實意義。

參考文獻：

[1] Chen L，Li H.FeedRes.(陳莉，李宏.飼料研究)，2004,7(10)：24-26.

[2] Yao L X，Huang L X，Jiang Z Y，He Z H，Zhou C M，Li G L.Environ.Sci.(姚麗賢，黃連喜，蔣宗勇，何兆桓，周昌敏，李國良.環(huán)境科學)，2013,34(2)：732-739.

[3] Ren A，Zhang B.Addit.World(任傲，張彬.添加劑世界)，2015,7：36-40.

[4] Yao X J，Wang M，Jiang S X，Xue F Q，Li H.Veter.Pharm.FeedAddit.(姚秀娟，王米，江善祥，薛飛群，李宏.獸藥與飼料添加劑)，2009,14(6)：11-13.

[5] Chen D M，Tao Y F，Wang Y L，Liu Z L，Yuan Z H.J.Agric.Sci.Technol.(陳冬梅，陶燕飛，王玉蓮，劉振利，袁宗輝.中國農業(yè)科技導報)，2008,10(Z2)：1-4.

[6] Chen S Z，Liu L P，Du Z X，Ma H.J.Chin.MassSpectrom.Soc.(陳紹占，劉麗萍，杜振霞，馬輝.質譜學報)，2015,36(1)：33-39.

[7] Wang P L，Tian J，Su X O.Chin.J.Anal.Chem.(王培龍，田靜，蘇曉鷗.分析化學)，2008,36(2)：215-218.

[8] Yang L J，Hu Q R，Guo W，Liu Y M，Song X H，Zhang P C.Chin.J.Chromatogr.(楊麗君，胡巧茹，郭偉，劉玉敏，宋曉華，張鵬程.色譜)，2011,29(5)：394-398.

[9] Huang H Q，Huang L L，Xia P.Chin.J.Chromatogr.(黃會秋，黃莉來，夏坪.色譜)，2016,34(9)：918-924.

[10] Huang L X，He Z H，Zeng F，Yao L X，Zhou C M，Guo B.Chin.J.Anal.Chem.(黃連喜，何兆桓，曾芳，姚麗賢，周昌敏，國彬.分析化學)，2010,38(9)：1321-1324.

[11] Wu S L，Yu J，Wang X M，Liu C，Wang K.J.FoodSaf.Qual.(吳思霖，于建，王欣美，劉暢，王柯.食品安全質量檢測學報)，2016,7(7)：2658-2662.

[12] Xiao Y B，Zhang M，Wen H W.Spectrosc.SpectralAnal.(肖亞兵， 張曼， 溫華蔚.光譜學與光譜分析)，2014,34(4)：1100-1103.

[13] Xiao Y B，Gao J H，Zeng Y，Ge B K，Xu H，Zhang M.J.Instrum.Anal.(肖亞兵，高健會，曾宇，葛寶坤，許泓，張曼.分析測試學報)，2008,27(11)：1206-1209.

[14] Leng T H，Li Q Q，Zhou Y，Peng Y F，Xie N，Duan W F.FoodInd.(冷桃花，李清清，周瑤，彭亞峰，解楠，段文鋒.食品工業(yè))，2012,33(7)：142-144.

[15] Cao C，Liu C Y，Wang Z J，Wu Z G，Cui C，Wu D D.J.Instrum.Anal.(曹璨，劉成雁，王志嘉，吳志剛，崔暢，吳冬冬.分析測試學報)，2017,36(6)：756-761.