肖曉峰，何 軍，劉艇飛，王建玲，陳 彤，楊娟娟，林 玲

(臺(tái)州出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 臺(tái)州 318000)

尼泊金酯，化學(xué)名為對(duì)羥基苯甲酸酯，常作為防霉防腐劑[1-2]廣泛應(yīng)用于塑料類食品接觸材料[3-4]、食品[5]、藥品[6-7]、化妝品[8]、潤(rùn)滑油[9]等的生產(chǎn)。尼泊金酯類化合物對(duì)人體有內(nèi)分泌干擾作用[8]，并具有生物累積和富集作用[10-12]。近年來(lái)研究顯示，尼泊金酯類化合物與人體肥胖[2]、變異原致敏[13]、精子DNA損傷[14]有關(guān)，甚至可能致癌[8]。特定遷移量是指食品接觸材料或相關(guān)制品在使用過(guò)程中遷移至食品或食品模擬物中的單種化合物的量，通常是檢測(cè)浸泡了實(shí)際食品接觸材料或相關(guān)制品樣品后食品模擬物中特定化合物的含量[3-4,15]。在使用過(guò)程中，塑料類食品接觸材料相關(guān)制品中殘留或降解的尼泊金酯類化合物如過(guò)度遷移到食物中，將會(huì)直接危害人體健康[15]。歐盟2011年發(fā)布的(EU)NO 10/ 2011法規(guī)[4],將尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的特定遷移量(SM)均限定為60 mg/kg。

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)食品[12,16]、藥品[6-7,17]、化妝品[8,17]、生物[11]、尿液[13-14]、人體組織[10]、潤(rùn)滑油[9]樣品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的檢測(cè)已有報(bào)道，檢測(cè)方法主要有高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)[6,9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[1,10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12]、流動(dòng)注射法[7]，而關(guān)于食品模擬物中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯遷移量的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

有機(jī)相陰離子交換(OPAE)固相萃取(SPE)技術(shù)[15]在處理植物油或植物油食品模擬物樣品中的酚類化合物時(shí)，具有操作簡(jiǎn)便、快速、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立了有機(jī)相陰離子交換固相萃取/HPLC-UV法快速測(cè)定食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇和橄欖油)中含酚羥基的尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的SM。該方法已成功應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯SM的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

1290超高效液相色譜儀、ZORBAX SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)購(gòu)于Agilent公司；SunFireTMC8柱和xBridgeTMC18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters公司)；Synergi 4u Polar-RP 80A柱(250 mm×4.6 mm，4 μm，菲羅門公司)；Oasis?MAX固相萃取柱(500 mg/6 mL，Waters公司);ELGA LA613純水儀(Veolia Water Solutions & Technologies公司)；親水性聚四氟乙烯、聚四氟乙烯過(guò)濾器(杭州格陵科學(xué)儀器有限公司)；尼泊金甲酯、尼泊金丙酯(純度≥99%，北京百靈威科技有限公司)；尼泊金乙酯(純度≥99%，Sigma-Aldrich公司)；尼泊金異丙酯(純度≥99%，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；甲醇(色譜純，Merck公司)；四氫呋喃(色譜純，Tedia公司)；橄欖油(化學(xué)純，阿拉丁生化科技有限公司)；其他試劑均為分析純。

混合標(biāo)準(zhǔn)(中間)儲(chǔ)備液的配制：稱取10 mg(精確至0.1 mg)尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A。吸取 0.5 mL儲(chǔ)備液A至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均為50.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液B；分別精密吸取儲(chǔ)備液B 1.0、2.0 mL至2個(gè)10 mL容量瓶中，分別精密吸取儲(chǔ)備液A 1.0、2.0、4.0、8.0 mL至4個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇定容，連同標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液A和B，得一組4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均分別為5.00、10.0、50.0、100、200、400、800、1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液C。

水基食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、20%乙醇和50%乙醇)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：以50%乙醇食品模擬物為例，分別精確移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液C至8個(gè)10 mL容量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，混勻，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液D；采用相同方式，用10%乙醇、3%乙酸或20%乙醇配制相同濃度系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

橄欖油食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別精確移取1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間儲(chǔ)備液C至8個(gè)10 mL容量瓶中，用0.1%甲酸四氫呋喃定容至刻度，混勻，得4種尼泊金酯質(zhì)量濃度均分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液E。

1.2 遷移試驗(yàn)

根據(jù)待測(cè)樣品的預(yù)期用途及使用條件，參照歐標(biāo)浸泡通則[18]和(EU) NO 10/2011法規(guī)，選擇合適的遷移試驗(yàn)條件。分別用10%乙醇(食品模擬物A)、3%乙酸(食品模擬物B)、20%乙醇(食品模擬物C)、50%乙醇(食品模擬物D1)和橄欖油(食品模擬物D2)浸泡樣品。對(duì)可能較短時(shí)間與食品高溫接觸的聚丙烯(PP)塑料杯/碗、聚碳酸酯(PC)水壺/杯和密胺碗/杯等樣品，在100 ℃或回流溫度下浸泡2 h；對(duì)可能較短時(shí)間與較高溫度食品接觸的聚對(duì)苯二甲酸二乙醇酯(PET)杯、聚乙烯(PE)塑料瓶等，在70 ℃浸泡2 h；對(duì)室溫下與食品長(zhǎng)時(shí)間接觸的聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)保鮮膜等樣品，在40 ℃浸泡10 d。

1.3 樣品前處理

食品模擬物浸泡待測(cè)樣品，冷卻至室溫并混勻。水基食品模擬物(3%乙酸、10%乙醇、20%乙醇和50%乙醇)樣品：用2 mL注射器吸取1.5～2 mL浸泡液，經(jīng)0.45 μm親水性聚四氟乙烯針頭過(guò)濾器過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

橄欖油食品模擬物樣品的制備參照OPAE SPE處理程序[15]稍加調(diào)整：稱取橄欖油模擬物5 g(精確至0.01 g)于20 mL容量瓶中，加入正己烷定容后渦旋混勻，待SPE上樣；用移液管準(zhǔn)確移取10 mL上樣液，上樣至經(jīng)6 mL正己烷平衡處理的Oasis?MAX SPE小柱中，用10 mL正庚烷淋洗SPE柱去除橄欖油干擾成分，殘留在柱床中的正庚烷用負(fù)壓抽干后，用5 mL 0.1%甲酸四氫呋喃溶液洗脫，洗脫液定容至5 mL，渦旋混勻后，用2 mL注射器吸取1.5～2 mL浸泡液，經(jīng)0.45 μm聚四氟乙烯針頭過(guò)濾器過(guò)濾至進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-Phenyl柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent公司)；流動(dòng)相為50%甲醇水溶液；洗脫方式為等度洗脫；流動(dòng)相流速為1 mL/min；水基食品模擬物進(jìn)樣量為20 μL，橄欖油樣品進(jìn)樣量為7.5 μL；柱溫箱溫度為40 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜分離條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯這兩種同分異構(gòu)體之間的色譜分離相對(duì)較困難，相關(guān)文獻(xiàn)在等度洗脫條件下[16]，始終不能將兩者有效分離。采用“1.4”除色譜柱外的色譜分離條件，比較了常見(jiàn)的C8、C18、苯基柱和極性反相柱在等度洗脫條件下對(duì)這4種尼泊金酯的色譜分離效果，結(jié)果如圖1所示。尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯在C8柱上的色譜分離未能達(dá)到基線分離，在C18柱上存在一定的伸舌現(xiàn)象，在極性反相柱上存在明顯的拖尾現(xiàn)象，而在苯基柱上則均可達(dá)到基線分離，且峰形對(duì)稱，故試驗(yàn)采用苯基柱進(jìn)行色譜分離。

2.1.2等度條件及柱溫的選擇采用“1.4”除流動(dòng)相比例外的色譜分離條件，在苯基柱上對(duì)比了45%甲醇水、50%甲醇水、55%甲醇水和60%甲醇水等度洗脫對(duì)4種尼泊金酯的色譜分離效果。結(jié)果表明，用45%甲醇水進(jìn)行洗脫時(shí)，尼泊金丙酯的出峰時(shí)間延長(zhǎng)至15 min；使用55%甲醇水或60%甲醇水進(jìn)行洗脫時(shí)，尼泊金甲酯在5 min左右出峰，保留較弱；選用50%甲醇水等度洗脫時(shí)，4種尼泊金酯的色譜分離和保留時(shí)間均較理想。由于50%甲醇水溶液比純水的粘度大，柱后壓較高，將柱溫箱的溫度提升至苯基柱能耐受的40 ℃，能有效降低柱后壓，并能獲得更好的色譜保留重現(xiàn)性。故試驗(yàn)采用50%甲醇水等度洗脫和40 ℃的柱溫。

2.1.3進(jìn)樣量的優(yōu)化考察了水基食品模擬物和橄欖油食品模擬物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的進(jìn)樣量對(duì)色譜分離和峰形的影響。采用“1.4”除進(jìn)樣量外的色譜分離條件，100 mg/mL的50%乙醇混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣1、5、10、15、20 μL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將進(jìn)樣量增加至20 μL未發(fā)生色譜分離保留時(shí)間延長(zhǎng)或色譜峰變形等異?，F(xiàn)象，其他3種水基食品模擬物也類似，故水基食品模擬物樣品的進(jìn)樣量選用20 μL。將100 mg/mL的0.1%甲酸四氫呋喃混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣1.0、2.5、5.0、7.5、10 μL，當(dāng)進(jìn)樣量增加至10 μL時(shí)，4種尼泊金酯的色譜峰出現(xiàn)明顯的伸舌或雙峰形變，故橄欖油食品模擬物樣品進(jìn)樣量選用7.5 μL。在上述優(yōu)化色譜條件下，5種食品模擬物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中的4種尼泊金酯色譜分離較理想。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1不同材質(zhì)針式濾膜過(guò)濾對(duì)回收率的影響水基食品模擬物采用過(guò)針頭式濾膜后直接進(jìn)樣的方式，可以有效去除樣品中的細(xì)小顆粒物或其他雜物，減少對(duì)色譜柱和儀器管道的堵塞?？疾炝?種常見(jiàn)材質(zhì)的針頭式濾膜(聚醚砜(PES)、尼龍(NL)和親水性聚四氟乙烯(PTFE))過(guò)濾操作對(duì)水基食品模擬物回收率的影響。將同一20 mg/L的水基食品模擬物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行過(guò)濾或直接進(jìn)樣，通過(guò)比較前述3種不同材質(zhì)的針頭式濾膜進(jìn)樣和直接進(jìn)樣時(shí)的色譜峰面積來(lái)計(jì)算回收率，每種水基食品模擬物均平行試驗(yàn)6次。發(fā)現(xiàn)在20%乙醇食品模擬物中，經(jīng)聚醚砜、尼龍和親水性聚四氟乙烯材質(zhì)的針頭式濾膜過(guò)濾處理后，4種尼泊金酯的回收率分別為93.6%～98.5%、81.8%～97.3%和98.8%～100%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.19%～0.44%、1.6%～4.3%、0.06%～0.23%，其他3種水基食品模擬物結(jié)果類似。實(shí)驗(yàn)表明親水性聚四氟乙烯的回收率最好，故水基食品模擬物均使用親水性聚四氟乙烯針頭濾膜過(guò)濾。

2.2.2有機(jī)相陰離子交換SPE法采用OPAE SPE法[15]對(duì)橄欖油食品模擬物樣品進(jìn)行前處理，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整：①橄欖油食品模擬物中4種尼泊金酯的OPAE SPE法操作過(guò)程中無(wú)需添加四甲基胍。雖然在OPAE SPE法操作程序中，添加四甲基胍能顯著增加某些酚類化合物過(guò)SPE柱的回收率[15]，但實(shí)驗(yàn)表明，4種尼泊金酯在不添加四甲基胍的情況下也獲得了滿意的回收率，故本文的OPAE SPE過(guò)程無(wú)需添加四甲基胍。②洗脫劑使用0.1%甲酸四氫呋喃能獲得滿意的洗脫效果。OPAE SPE法中上樣溶劑使用了強(qiáng)堿性的四甲基胍，在洗脫時(shí)需要使用較高濃度(0.5%)的甲酸以保證洗脫時(shí)SPE柱的酸性環(huán)境，而本文未添加四甲基胍，洗脫時(shí)只需使用0.1%甲酸四氫呋喃即可獲得滿意的洗脫效果。與常規(guī)的陰離子交換SPE操作方法相比，OPAE SPE法分析橄欖油中含酚羥基的目標(biāo)化合物具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、回收率高，可高效富集和凈化的特點(diǎn)，而常規(guī)的陰離子交換SPE操作方法，需采用水溶液反復(fù)提取橄欖油中含酚羥基的目標(biāo)化合物，操作繁瑣，并且由于水溶液提取效果不佳而導(dǎo)致回收率不理想。

2.3 方法的線性關(guān)系及定量下限

將“1.1”配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次進(jìn)樣測(cè)定，以質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo),色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制校正曲線，回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。5種食品模擬物中4種尼泊金酯在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2≥0.999 8),符合定量檢測(cè)要求；考察了校準(zhǔn)曲線工作溶液最低點(diǎn)的信噪比，以信噪比(S/N)為10作為方法定量下限(LOQ)，4種尼泊金酯在5種食品模擬物中的LOQ為0.1～0.5 mg/kg,滿足歐盟(EU)NO 10/ 2011法規(guī)的限量(60 mg/kg)要求。

表1 4種尼泊金酯的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、線性方程及定量下限Table 1 Linear ranges，correlation coefficients，regression equations,limits of quantitation for 4 parabens

2.4 回收率與精密度

用實(shí)際樣品浸泡液加標(biāo)的方式進(jìn)行回收率試驗(yàn)。每種食品模擬物浸泡液分別添加4種尼泊金酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至10、50、100 mg/kg，按照“1.3”步驟處理，加標(biāo)回收率結(jié)果如表1所示，4種尼泊金酯在5種食品模擬物中的加標(biāo)回收率為97.9%～103%,RSD為0.02%～2.2%，說(shuō)明本方法對(duì)包括采用了OPAE SPE法[15]進(jìn)行前處理的橄欖油食品模擬物浸泡液在內(nèi)的5種食品模擬物樣品，有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法檢測(cè)了聚丙烯(PP)塑料杯、PP碗、聚碳酸酯(PC)水壺、PC杯、密胺碗、密胺杯、聚對(duì)苯二甲酸二乙醇酯(PET)杯、聚乙烯(PE)塑料瓶、聚氯乙烯(PVC)和聚乙烯(PE)保鮮膜等常見(jiàn)食品接觸材料樣品共50余批次，在一款密胺復(fù)合材質(zhì)藍(lán)色波浪碗的50%乙醇食品模擬物浸泡液中檢出尼泊金異丙酯(圖2B)。50余批次樣品的食品模擬物浸泡液均無(wú)明顯干擾，實(shí)際樣品的典型色譜圖見(jiàn)圖2。且5種食品模擬物浸泡液加標(biāo)回收率和精密度好，表明該方法具有較好的實(shí)用性。

圖2 50%乙醇浸泡不同材質(zhì)的食品接觸材料制品的典型色譜圖Fig.2 Typical chromatograms of soaking solution of 50%ethanol from different types of food contacting samplesA:5 mg/kg mixing standard;B:melamine composite bowl;1：methylparaben；2:ethylparaben;3:isopropylparaben；4：propylparaben

3 結(jié) 論

本文建立了有機(jī)相陰離子交換固相萃取/HPLC-UV法快速測(cè)定食品接觸材料中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的SM。該方法具有樣品處理簡(jiǎn)單快速、色譜分離效果和線性相關(guān)性好、回收率和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，且方法的定量下限低，完全能滿足歐盟(EU)NO 10/ 2011法規(guī)的限量要求。該方法已應(yīng)用于多種食品接觸材料相關(guān)制品中尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金異丙酯和尼泊金丙酯的檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于食品接觸材料相關(guān)制品中此4種尼泊金酯化合物的進(jìn)出口監(jiān)管及產(chǎn)品質(zhì)量控制。

參考文獻(xiàn)：

[1] Han C,Xia B Q,Chen X Z,Shen J C,Miao Q,Shen Y.FoodChem.,2016,194:1199-1207.

[2] Boberg J,Taxvig C,Christiansen S,Hass U.Reprod.Toxicol.,2010,30:301-312.

[3] GB 9685-2016.National Food Safety Standard Standard for Uses of Additives in Food Containers and Packageing Materials.National Standard of the People’s Republic of China(食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn).中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)).

[4] Commission Regulation(EU) No 10/2011.

[5] GB 2760-2014.National Food Safety Standard for Uses of Food Additives.National Standard of the People’s Republic of China(食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn).中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)).

[6] Bhosale D M,Nikalje A P G.J.AOACInt.,2017,100:1407-1413.

[7] Turk S C,Satana E,Basan H,Goger N G.J.Anal.Chem.,2015,70:50-54.

[8] Grzeskowiak T,Czarczynska-Goslinska B,Zgola-Grzeskowiak A.TrAC，TrendsAnal.Chem.,2016:75:209-226.

[9] Shabir G A.J.Liq.Chromatogr.RelatedTechnol.,2011,34:679-689.

[10] Valle-Sistac J,Molins-Delgado D,Diaz M,Ibanez L,Barcelo D,Diaz-Cruz M S.Environ.Int.,2016,88:243-249.

[11] Villaverde-de-Saa E,Rodil R,Benito Q J,Cela R.J.Chromatogr.A,2016,1459:57-66.

[12] Djatinika R,Hsieh C C,Chen J M,Ding W H.J.Chromatogr.B,2016,1036:93-99.

[13] Savage J H,Matsui E C,Wood R A,Keet C A.J.AllergyClin.Immunol.,2012,130:453-459.

[14] Meeker J D,Yang T,Ye X Y,Calafat A M,Hauser R.Environ.HealthPerspect.,2011,119:252-257.

[15] Wang J L,Xiao X F,Chen T,Liu T F,Tao H M,He J.J.Chromatogr.A,2016,1451:58-66.

[16] Cao S R,Liu Z Y,Zhang L,Li X L,Wang G M,Tang B B,Yuan R.Chin.J.Anal.Chem.(曹淑瑞,劉治勇,張雷,李賢良,王國(guó)民,唐柏彬,袁若.分析化學(xué)),2012,40:529-533.

[17] Baytak A K,Teker T,Duzmen S,Aslanoglu M.Mat.Sci.Eng.C,2017,72:301-307.

[18] BS EN 13130-1-2004.Material and Articals in Contact with Food Stuff-Plastic Substances Subject to Limitation-Part 1:Guide to Test Method for the Specific Migration of Substances from Plastics to Foods and Food Simulants and the Determination of Substances in Plastics and the Selection of Conditions of Exposure to Food Simulants.