姚余華,田海玉,裴曉良,陳 揚(yáng),張維冰,錢俊紅

(上海市功能性材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院,上海 200237)

含硫化合物如亞硫酸鹽、硫化氫和硫醇是常用的化學(xué)試劑[1-3],在環(huán)境和生物領(lǐng)域亦發(fā)揮著不同的作用[4-5]。亞硫酸鹽能有效防止食物氧化變質(zhì)，是一種常見的食品添加劑、藥物保鮮劑和防腐劑[6-8]。在生物體內(nèi)，亞硫酸鹽參與很多重要的生理過程，例如調(diào)節(jié)心血管功能和提高細(xì)胞的抗氧化能力[9-11]。然而，過量攝入亞硫酸鹽會(huì)對(duì)人體造成傷害，嚴(yán)重時(shí)可能引發(fā)某些疾病。因此，許多國家制定了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)控制食品、藥品中亞硫酸鹽的含量。H2S是繼NO和CO之后的第3種氣體信號(hào)分子[12-13]，具有重要的生物活性，可參與有機(jī)體的多種生理、病理過程，如調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、抑制胰島素分泌等[14]，其濃度異?？赡芘c哮喘、胃腸痛等多種疾病有關(guān)。因此，建立快速、靈敏、高選擇性地檢測(cè)上述含硫物質(zhì)的分析方法對(duì)食品安全、疾病診斷等具有重要意義[15]。熒光檢測(cè)法因靈敏度高、選擇性好和響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)在分析化學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。基于含硫化合物與金屬離子的絡(luò)合作用[16]、親核活性[17]、還原作用[18]以及與醛基反應(yīng)[19]等特性，科學(xué)工作者設(shè)計(jì)合成了很多熒光探針用于此類物質(zhì)的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher Scientific,Evolution 220),熒光光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific,Lumina),核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司,AV-400)，質(zhì)譜儀(美國,MA 1212),超純水儀(德國Sartorius)；所用藥品均購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司或阿拉丁試劑上海有限公司，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 探針合成

1.2.1化合物m1的合成根據(jù)文獻(xiàn)的方法合成得到中間體m1[20]。

1.2.2化合物m2的合成在100 mL圓底燒瓶中加入苯乙酮(0.024 mol,2.8 mL)、丙二腈(0.024 mol,1.59 g)、醋酸銨(0.2 mol,0.37 g)、冰醋酸(1.1 mol，1.5 mL)和甲苯(20 mL)，將反應(yīng)液加熱回流1 h后冷卻至室溫，再用150 mL飽和碳酸氫鈉溶液和50 mL水依次洗滌后，旋蒸除去溶劑，所得固體用無水乙醇重結(jié)晶，得到白色固體m2(2.41 g,60%)。1H NMR(CDC13,400 MHz)δ(ppm):2.65(s,3 H),7.54(m,5 H)。

圖1 探針MSP的合成路線Fig.1 The synthesis procedures of probe MSP

1.2.3探針MSP的合成將1 mL吡咯烷滴加至溶有1.0 gm1(3.72 mmol) 和1.8倍當(dāng)量m2的50 mL CH2Cl2/EtOH(體積比為1∶1)溶液中。將混合液在室溫下攪拌10 h后減壓去除溶劑，所得固體用硅膠柱(DCM/EA=2∶1)分離后得到深黑色晶體即為探針MSP(0.75 g，48%),其合成路線見圖1。1H NMR(CDC13,400 MHz)δ(ppm):1.97(m,4 H),2.76(t,2 H,J=6.10 Hz),2.86(t,2 H,J=6.35 Hz),3.35(q,4 H),6.91(m,2 H),7.34(d,1 H),7.36(d,1 H),7.44(m,1 H),7.52(m,3 H),7.70(s,1 H),7.88(d,1 H)。HR-MSm/z:420.170 7(M+H)+,C23H21N2O3+理論計(jì)算值:420.163 4(M+H)+。

1.3 溶液配制

準(zhǔn)確稱取MSP溶于DMF中，配制3 mmol/L MSP儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確稱取Na2SO3和Na2S分別溶于一定體積的PBS(20 mmol/L,pH 7.4)緩沖溶液中，配制成30 mmol/L的Na2SO3或Na2S儲(chǔ)備液；按上述方法配制30 mmol/L的其他分析物儲(chǔ)備液。

1.4 滴定實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確量取10 μL探針儲(chǔ)備液于3 mL PBS中配成10 μmol/L的探針溶液，再加入不同體積的Na2SO3或Na2S儲(chǔ)備液，得到一系列不同濃度的待測(cè)樣品溶液。放置10 min(Na2SO3)或3 h(Na2S)后測(cè)試體系的吸收和發(fā)射光譜。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

移取200 μL L929細(xì)胞液于2 mL細(xì)胞培養(yǎng)皿中，將其置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，用2 mL含10%胎牛血清的Dulbecco’s改良培養(yǎng)基(DEME)培養(yǎng)24 h。此后，用無菌PBS(20 mmol/L，pH 7.4)沖洗細(xì)胞3次，再用含有10 μmol/L探針MSP的無血清DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min。Na2SO3或Na2S測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞用無菌PBS沖洗3次前，先用含0.5 mmol/L Na2SO3/Na2S的無血清DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min/3 h，后續(xù)操作與前述一致。最后，幾個(gè)試樣均用無菌PBS沖洗3次后進(jìn)行熒光成像。在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，同時(shí)采集綠色通道(500～550 nm)和紅色通道(662～737 nm)的熒光信號(hào)。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對(duì)亞硫酸鹽及硫化氫的光譜響應(yīng)

由圖2可知，探針MSP的最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)分別位于572 nm和690 nm(圖2A～B)，較長(zhǎng)的發(fā)射波長(zhǎng)使其在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有潛在應(yīng)用。為研究探針對(duì)含硫化合物的光譜響應(yīng)，首先測(cè)試了PBS-DMF緩沖溶液中(20 mmol/L,pH 7.4,體積比1∶2)亞硫酸鹽與探針混合體系的吸收光譜隨時(shí)間的變化曲線。由圖2A可知，亞硫酸鹽的加入使得探針MSP在572 nm處的吸收峰強(qiáng)度迅速降低，同時(shí)在464 nm處產(chǎn)生一個(gè)新的吸收峰，后者的吸光度在2 min內(nèi)達(dá)到最大值，且在484 nm處出現(xiàn)一個(gè)等吸收點(diǎn)，表明該體系中生成了新的化合物，此時(shí)溶液顏色由橙紅色變成淡黃色。同時(shí)，探針MSP在 690 nm處的發(fā)射峰迅速降低并在510 nm處出現(xiàn)了一個(gè)新的發(fā)射峰(圖2B)；在熒光燈照射下，溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)綠色。隨后，又研究了探針MSP對(duì)硫化氫的光譜響應(yīng)(圖2C～D)，與亞硫酸鹽類似，硫化氫的加入亦使得探針的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)明顯藍(lán)移，但MSP-H2S體系的光譜變化較為緩慢。從圖2E可以更直觀地看出，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至3 h時(shí)，MSP-H2S體系的光譜變化才趨于平衡，在反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，該體系的光譜變化較小，而MSP-Na2SO3體系已達(dá)到平衡。值得注意的是，當(dāng)探針MSP與硫化氫的反應(yīng)時(shí)間達(dá)3 h時(shí)，探針在510 nm處的熒光強(qiáng)度急劇增大，其與690 nm處的熒光強(qiáng)度相比(I510/I690)增加了260倍(圖2F)，遠(yuǎn)高于亞硫酸鹽對(duì)探針熒光光譜的影響。上述結(jié)果表明，該探針對(duì)亞硫酸鹽和硫化氫的響應(yīng)速度不同，且兩種含硫化合物對(duì)探針的熒光光譜影響也有明顯差異。因此，可利用反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硫酸鹽和硫化氫的區(qū)分檢測(cè)。

2.2 探針對(duì)亞硫酸鹽及硫化氫的選擇性與競(jìng)爭(zhēng)性

測(cè)試了其他潛在干擾物(多種陰離子與生物硫醇)與亞硫酸鹽/硫化氫共存時(shí)對(duì)探針MSP的光譜影響。結(jié)果顯示，上述干擾物幾乎不干擾探針對(duì)亞硫酸鹽和硫化氫的檢測(cè)，表明探針MSP具有良好的選擇性和競(jìng)爭(zhēng)性，可用于對(duì)實(shí)際樣品中亞硫酸鹽和硫化氫的檢測(cè)。

2.3 亞硫酸鹽與硫化氫濃度對(duì)探針光譜性質(zhì)的影響

線性范圍和檢出限是探針定量檢測(cè)的重要指標(biāo)。分別選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min和3 h研究了亞硫酸鹽(圖5A)和硫化氫(圖5B)濃度對(duì)探針MSP吸收/發(fā)射光譜的影響。由圖5A可知，隨著亞硫酸鹽濃度的增大，探針在572 nm處的吸光度值逐漸降低，464 nm處產(chǎn)生一新的吸收峰且其強(qiáng)度隨亞硫酸鹽濃度的增加而逐漸增大，當(dāng)亞硫酸鹽濃度達(dá)到400 μmol/L時(shí)，探針溶液的吸收光譜幾乎不變。以探針在464 nm和572 nm處的吸收強(qiáng)度比(A464/A572)對(duì)亞硫酸鹽濃度作圖可知，在0～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，A464/A572與亞硫酸鹽濃度呈良好的線性關(guān)系(r2=0.984 3)，其對(duì)亞硫酸鹽的檢出限(3σ/k)為0.95 μmol/L。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)，在0～500 μmol/L濃度范圍內(nèi)，I510/I690與硫化氫濃度呈線性關(guān)系(r2=0.993 7)，對(duì)硫化氫的檢出限(3σ/k)為0.6 μmol/L。以上結(jié)果表明探針MSP在亞硫酸鹽和硫化氫高選擇性、高靈敏度定量方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.4 探針對(duì)亞硫酸鹽及硫化氫的細(xì)胞成像

將探針MSP用于對(duì)L929細(xì)胞中亞硫酸鹽和硫化氫的熒光成像，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)細(xì)胞僅用探針MSP培養(yǎng)后，在紅色通道顯示較強(qiáng)的熒光，而綠色通道幾乎沒有熒光(圖6A～D)。當(dāng)L929細(xì)胞先用Na2SO3培養(yǎng)30 min后再用探針MSP培養(yǎng)30 min，可觀察到細(xì)胞內(nèi)綠色熒光略有增強(qiáng)，同時(shí)紅色熒光明顯降低(圖6E～H)；當(dāng)L929細(xì)胞先用Na2S培養(yǎng)3 h再用探針培養(yǎng)30 min后，細(xì)胞內(nèi)觀察到很強(qiáng)的綠色熒光，而紅色熒光顯著降低(圖6I～L)。上述結(jié)果表明，探針MSP在區(qū)分檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽和硫化氫方面有潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖6 L929細(xì)胞的熒光成像圖Fig.6 Fluorescence imaging of L929 cellsA-D:L929 cells incubated with MSP for 30 min(用探針MSP培養(yǎng)30 min);E-H:L929 cells were pretreated with Na2SO3 for 30 min then incubated with MSP for further 30 min(L929細(xì)胞先用Na2SO3培養(yǎng)30 min再用探針MSP培養(yǎng)30 min);I-L:L929 cells were pretreated with Na2S for 3 h then incubated with MSP for another 30 min(L929細(xì)胞先用Na2S培養(yǎng)3 h再用探針MSP培養(yǎng)30 min)；A,E,I:green channel obtained from 500-550 nm;B,F,J:red channel obtained from 662-737 nm;C,G,K:bright field;D,H,L:merged imaging;[MSP]=10 μmol/L,[Na2SO3]=0.5 mmol/L,[H2S]=0.5 mmol/L,excited at the 488 nm

3 結(jié) 論

本文基于亞硫酸鹽與硫化氫親核活性的差異，設(shè)計(jì)合成了一個(gè)香豆素類比率熒光探針MSP用于對(duì)兩者進(jìn)行區(qū)分檢測(cè)。通過將強(qiáng)吸電子基團(tuán)二氰基亞甲基苯共軛連接到香豆素?zé)晒鈭F(tuán)上，使得探針具有較長(zhǎng)的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)(λab=572 nm，λem=690 nm)以及較高的反應(yīng)活性。該探針可實(shí)現(xiàn)對(duì)亞硫酸鹽的快速、比色響應(yīng)以及對(duì)硫化氫的比率熒光響應(yīng),并可用于活細(xì)胞內(nèi)亞硫酸鹽和硫化氫的熒光成像。

參考文獻(xiàn)：

[1] Abedinzadeh Z.Can.J.Physiol.Pharm.,2001,79(2):166-170.

[2] Calvert J W,Jha S,Gundewar S,Elrod J W,Ramachandran A,Pattillo C B,Kevil C G,Lefer D J.Circ.Res.,2009,105(4):365-374.

[3] Gupta S C,Kim J H,Prasad S,Aggarwal B B.CancerMetast.Rev.,2010,29(3):405-434.

[4] Benson S W.Chem.Rev.,1978,78(1):23-25.

[5] Noji M,Saito M,Nakamura M,Aono M,Saji H,Saito K.PlantPhysiol.,2001,126(3):973-980.

[6] Mcfeeters R F.J.FoodProt.,1998,61(7):885-890.

[7] Xu J,Liu K,Di D L,Shao S J,Guo Y.Inorg.Chem.Commun.,2007,10(6):681-684.

[8] Mischek D,Krapfenbauer-Cermak C.FoodAddit.Contam.,2012,29(3):371-382.

[9] Dietrich-Muszalska A,Malinowska J,Olas B,Glowacki R,Bald E,Wachowicz B,Rabe-Jablonska J.Neurochem.Res.,2012,37(5):1057-1062.

[10] Li J L,Li R J,Meng Z Q.Eur.J.Pharmacol.,2010,645(1):143-150.

[11] Wang X B,Jin H F,Tang C S,Du J B.Eur.J.Pharmacol.,2011,670(1):1-6.

[12] Li L,Rose P,Moore P K.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,2011,51(1):169-187.

[13] Moore P K,Bhatia M,Moochhala S.TrendsPharmacol.Sci.,2003,24(12):609-611.

[14] Abe K,Kimura H.J.Neurosci.,1996,16(3):1066-1071.

[15] Li Y J,Zhao M P.FoodControl,2006,17(12):975-980.

[16] Krizek B A,Amann B T,Kilfoil V J,Merkle D L,Berg J M.J.Am.Chem.Soc.,1991,113(12):4518-4523.

[17] Chan J W,Hoyle C E,Lowe A B.J.Am.Chem.Soc.,2009,131(16):5751-5753.

[18] Xuan W M,Sheng C Q,Cao Y T,He W H,Wang W.Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51(10):2282-2284.

[19] Lin V S,Chang C J.Curr.Opin.Chem.Biol.,2012,16(5):595-601.

[20] Pei X L,Tian H Y,Zhang W B,Brouwer A M,Qian J H.Analyst,2014,139(20):5290-5296.

[21] Sun Q,Zhang W B,Qian J H.Talanta,2017,162:107-113.

[22] Liu S S,Song L,Sun Q,Chen Z Y,Ge Y,Zhang W B,Qian J H.RSCAdv.,2015,5(111):91863-91868.

[23] Tian H Y,Qian J H,Sun Q,Jiang C J,Zhang R S,Zhang W B.Analyst,2014,139(13):3373-3377.