周吉秋 許 雄 陳建新 張 森

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021）

膿毒癥是一種由感染導(dǎo)致的機(jī)體反應(yīng)對(duì)機(jī)體本身和器官組織造成損害而導(dǎo)致的致命性疾病，新的膿毒癥定義更加明確地強(qiáng)調(diào)紊亂的宿主反應(yīng)和嚴(yán)重的致死性器官功能障礙是膿毒癥區(qū)別于其他感染的主要元素［1］。1973 年，高遷移率蛋白（high mobility group protein，HMG）首次被提取并鑒定，由于它們?cè)诰郾０纺z電泳中擁有較高的遷移能力，故而得名［2］。 HMG 家族包括了 HMGA、HMGB 和 HMGN三個(gè)亞族，在真核生物的細(xì)胞中普遍存在；HMGB家族中又有三種蛋白，分別是HMGB1、HMGB2以及HMGB3［3］。1999 年，Wang等首先證實(shí)了 HMGB1 是小鼠體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的晚期炎癥因子［4］，此后HMGB1便逐漸成為重癥膿毒癥相關(guān)的一個(gè)研究方向［5］。白介素 1（interleukin 1，IL1）、白介素 6（interleukin 6，IL6）和腫瘤壞死因子（tumor Necrosis Factor，TNF）等為早期炎癥因子，其半衰期較短、在炎癥發(fā)生后的短時(shí)間內(nèi)即大量釋放并發(fā)揮作用［6］，而HMGB1等晚期炎癥因子則在疾病進(jìn)展了一段時(shí)間后才得以大量釋放且持續(xù)釋放時(shí)間較長，故它們或具有相對(duì)更高的臨床檢測價(jià)值，針對(duì)晚期炎癥因子的干預(yù)或有望成為治療膿毒癥的一個(gè)新方向。

瓜氨酸是一種非存在于蛋白質(zhì)中的L-a-氨基酸，我們的前期研究［7］發(fā)現(xiàn)瓜氨酸可有效地延緩膿毒癥大鼠早期炎癥因子的釋放，并可以提升機(jī)體后期抗炎細(xì)胞因子的釋放水平，一定程度上降低了大鼠的膿毒癥嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠盲腸結(jié)扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）模型，通過灌胃給藥外源性瓜氨酸，對(duì)膿毒癥大鼠結(jié)腸組織病理改變以及HMGB1表達(dá)水平的影響進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 CLP造模選擇無特定病原體（specified pathogen free，SPF）等級(jí)、（300.00±50.00） g、8～10周齡健康雄性SD大鼠140只。大鼠先于廣西醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)1 w以適應(yīng)新環(huán)境。室溫控制在25℃左右，空氣濕度控制在50%左右，每日光照12 h模擬正常晝夜節(jié)律，大鼠皆自由飲食。

1.2 模型分組 設(shè)正常組（Normal組）、假手術(shù)組（Sham 組）、CLP 手術(shù)的給藥組（CLP+Cit組）和未給藥組（CLP組）四組。Normal組大鼠不做任何特殊處理；Sham組大鼠行假手術(shù)，即腹腔注射水合氯醛麻醉后打開大鼠腹腔，輕微翻動(dòng)盲腸附近腸管后立刻縫合切口，不行CLP術(shù)；CLP組大鼠進(jìn)行CLP手術(shù)；CLP+Cit組大鼠需在CLP手術(shù)前使用L-瓜氨酸按200 mg/（kg·d）的劑量連續(xù)灌胃給藥 1 w。 Normal組和Sham組每組準(zhǔn)備8只大鼠。由于HMGB1主要在膿毒癥發(fā)生后約24～48 h達(dá)到峰值，故對(duì)CLP+Cit組和CLP組兩組大鼠按術(shù)后取樣的時(shí)間點(diǎn)分別各設(shè) 6 h（10 只）、12 h（12 只）、24 h（16 只）、48 h（24只）四個(gè)亞組。各組中的大鼠皆按隨機(jī)分配入組，每組大鼠數(shù)量根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)預(yù)估每組死亡率得出，以確保每組大鼠都能取6～8只存活樣本。

1.3 CLP手術(shù)操作及造模結(jié)果判斷 （1）CLP手術(shù)前12 h對(duì)大鼠進(jìn)行禁食，術(shù)前6 h進(jìn)行禁飲。CLP手術(shù)操作主要參考 Wen［8］和 Siempos II［9］等文獻(xiàn)報(bào)告。具體步驟如下：（1）每只大鼠稱量后按0.30 mL/100 g的劑量為大鼠腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉；（2）編號(hào)并備皮后用組織剪于腹部正中剪開長度約1.5 cm的縱行切口；（3）打開腹腔后，用鑷子小心夾出盲腸，放置于預(yù)先蓋在大鼠腹部的用生理鹽水濕潤過的無菌小方紗上；（4）將盲腸內(nèi)容物用手輕輕擠壓至盲腸游離末端，以確保結(jié)扎穿孔段腸管內(nèi)有足夠內(nèi)容物，并取4.0號(hào)縫線在盲腸中段部位結(jié)扎；（5）用21G針頭貫穿被結(jié)扎段盲腸的中間部分，移去針頭后適當(dāng)擠壓結(jié)扎段腸管，使部分腸內(nèi)容物通過穿刺后留下的孔道流出，小心地將盲腸從切口處回納入腹腔，并盡量不要觸碰到切口以免切口感染，這些外流的腸內(nèi)容物將是引起大鼠膿毒癥發(fā)生的誘因；（6）使用4.0號(hào)縫線間斷縫合手術(shù)切口；（7）以4 mL/100g的劑量皮下注射溫?zé)嵘睇}水，并用電烤燈供暖直至大鼠蘇醒。蘇醒后的大鼠送回動(dòng)物房內(nèi)繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)。（8）膿毒癥大鼠模型造模是否成功參考Wen［8］的文獻(xiàn)報(bào)告。

1.4 生存率情況 造模后，每次取樣前觀察該取樣組大鼠生存狀態(tài)，并記錄相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各組大鼠生存率。

1.5 實(shí)驗(yàn)樣本采集及處理 （1）取樣選擇：Normal組和Sham組在術(shù)后24 h取樣；CLP組與CLP+Cit組在造模之后的 6 h、12 h、24 h、48 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別在對(duì)應(yīng)亞組存活的大鼠中各隨機(jī)選取8只取樣，如存活數(shù)量不滿8只則全部取樣。（2）樣本采集及處理：取樣時(shí)先沿著原切口打開麻醉后的大鼠腹腔，在盡量避免切口大量出血的情況下觀察腹腔內(nèi)大致的病變情況，再擴(kuò)大切口，用濕潤小方紗小心鈍性分離出腹主動(dòng)脈，使用28G采血針以約30°斜刺入腹主動(dòng)脈后立即接上5 mL真空采血管（紅管），收集約5 mL動(dòng)脈血。采血完成后用血管夾夾閉動(dòng)脈近心端，找到結(jié)腸并剪去腸系膜分離出一段腸管，剪下約1 cm結(jié)腸腸管，在生理鹽水中洗凈后放入裝有福爾馬林溶液的EP管中固定。大鼠結(jié)腸組織在室溫下固定24 h后做石蠟包埋，切片后做HE染色，顯微鏡下觀察比較各組大鼠結(jié)腸組織的病理改變。

1.6 血清HMGB1水平檢測 血液樣本于常溫下靜置2 h后以3000 g轉(zhuǎn)速離心15 min，分離出上清液并轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，即為血清。將血清分裝后立即凍存于-80℃冰箱中。檢測前取各組凍存血清樣本放置于4℃冰箱解凍，HMGB1水平使用武漢華美ELISA 試劑盒（LOT：Q22013238）檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。大鼠HMGB1水平正常參考范圍0～200 pg/mL。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（）形式描述，組間比較采用t檢驗(yàn)，符合偏態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（P25，P75）表示；計(jì)數(shù)資料采用［n（%）］表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。以雙側(cè)Ρ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般狀態(tài) 在各取樣時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠的一般狀態(tài)與存活情況。（1）Normal組和Sham組的大鼠精神狀態(tài)良好，飲食排便狀況無異常，被毛柔順，且在造模后24 h取樣前無死亡，生存率皆為100%。（2）兩組CLP手術(shù)大鼠在造模后逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、豎毛等情況，部分大鼠出現(xiàn)排稀便、血便的情況。24 h時(shí)CLP組大鼠打開腹腔后可見大量血性腹水，腸管腫脹擴(kuò)張，結(jié)扎處附近腸段部分壞死，盲腸周圍內(nèi)臟多有嚴(yán)重粘連，見圖1及圖3，造模成功［8］；而相同時(shí)間點(diǎn)的CLP+Cit組大鼠則腹水較少且多無血性，腸管水腫壞死情況以及內(nèi)臟粘連情況也較CLP組更輕，見圖2及圖4。48 h時(shí)兩組打開腹腔后可見大體差異較24 h小。

2.2 大鼠生存率 CLP組與CLP+Cit組大鼠在6 h生存率均為100%。兩組在12 h、24 h、48 h四個(gè)時(shí)點(diǎn)的生存率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

圖1 CLP組24 h腹腔積液

圖2 CLP+Cit組24 h腹腔積液

圖3 CLP組24 h腹腔器官

圖4 CLP+Cit組24h腹腔器官

表1 CLP與CLP+Cit組大鼠各檢測時(shí)點(diǎn)生存率比較［n（%）］

2.3 大鼠結(jié)腸組織病理觀察 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色后在100倍光鏡下可見：（1）Normal組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，無水腫，無炎癥細(xì)胞浸潤，見圖5；（2）Sham組大鼠結(jié)腸組織有輕微水腫，幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤，見圖6；（3）CLP組 24 h大鼠結(jié)腸組織有大量炎癥細(xì)胞浸潤，結(jié)腸組織水腫，見圖7；（4）CLP+Cit組24 h大鼠結(jié)腸組織有炎性細(xì)胞浸潤但程度輕于 CLP組，結(jié)腸組織水腫明顯，見圖8。CLP組與CLP+Cit組大鼠的結(jié)腸病理切片在40倍鏡下比較，可見CLP組的大鼠結(jié)腸組織炎癥細(xì)胞浸潤程度明顯重于CLP+Cit組，兩組均可見組織水腫，見圖9及圖10。

圖5 Normal組結(jié)腸組織（HE×100）

圖6 Sham 組結(jié)腸組織（HE×100）

圖7 CLP組 24 h結(jié)腸組織（HE×100）

圖8 CLP+Cit組 24 h結(jié)腸組織（HE×100）

圖9 CLP組 24 h結(jié)腸組織（HE×40）

圖10 CLP+Cit組 24 h結(jié)腸組織（HE×40）

表2 CLP與CLP+Cit組大鼠血清HMGB1水平（pg/mL，）

表2 CLP與CLP+Cit組大鼠血清HMGB1水平（pg/mL，）

組別 6 h 12 h 24 h 48 h CLP 842.21±229.45 1513.09±303.71 2751.91±630.43 872.37±378.85 CLP+Cit 921.66±156.01 955.36±199.43 1489.30±254.69 298.47±149.30 t-0.810 -4.132 -5.252 3.986 P 0.432 0.001 0.000 0.001

2.4 大鼠血清HMGB1水平 Normal組和Sham組HMGB1實(shí)測值均在正常值參考范圍內(nèi)，Normal組平均水平為 21.39 （0，25.08）pg/mL，Sham 組平均水平為78.25（0，100.33）pg/mL。在進(jìn)行檢測的四個(gè)時(shí)點(diǎn)中，CLP組與CLP+Cit組HMGB1水平均在24 h測得最高值，且在12 h、24 h、48 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)上兩組HMGB1水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

3 討 論

精氨酸是一種雙基氨基酸，在機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)或創(chuàng)傷修復(fù)時(shí)發(fā)揮作用，在細(xì)胞再生、傷口愈合、免疫功能、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面均有重要作用，并參與維持機(jī)體正氮平衡與正常的生理功能，有效提升機(jī)體的耐受力，但血漿及肌肉中的精氨酸水平會(huì)在膿毒癥發(fā)生時(shí)顯著降低［10］。 此外，Lortie 等［11］的研究表明，發(fā)生膿毒癥時(shí)直接給患者補(bǔ)充精氨酸并沒有明顯的緩解效果，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［12］中還發(fā)現(xiàn)直接使用精氨酸給藥會(huì)顯著加重膿毒癥大鼠的膿毒性休克情況，增加死亡率，其原因在于體內(nèi)過量的精氨酸會(huì)與iNOS反應(yīng)產(chǎn)生多余的NO，而NO會(huì)損害心血管系統(tǒng)，出現(xiàn)組織供氧不足等癥狀，從而進(jìn)一步加重病情的發(fā)展［13］。

瓜氨酸是一種特殊的氨基酸，并不存在于蛋白質(zhì)中。瓜氨酸在細(xì)胞中參與精氨酸合成NO的內(nèi)循環(huán)過程，該內(nèi)循環(huán)即為“瓜氨酸-一氧化氮循環(huán)（Cit-NO cycle）”，由于該循環(huán)為可逆反應(yīng)，存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，因此與精氨酸結(jié)構(gòu)相似的瓜氨酸作為合成精氨酸的前體，不僅能促進(jìn)精氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并提升精氨酸的作用，還可以競爭性地抑制酶活性中心，對(duì)NO生成進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而有效維持細(xì)胞內(nèi)精氨酸和NO水平的相對(duì)穩(wěn)定，確保反應(yīng)的持續(xù)性［14-15］。此外，瓜氨酸還對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，包括擴(kuò)血管、降血壓等［16］。因此相對(duì)于精氨酸，瓜氨酸或在治療膿毒癥的臨床應(yīng)用中可發(fā)揮更大的效用。

膿毒癥可以導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的大量釋放以及免疫功能混亂，大部分早期炎癥介質(zhì)半衰期短且臨床上不易檢測到其峰值，因此其拮抗劑在臨床應(yīng)用中的作用并不顯著［6］。而如HMGB1這樣的晚期炎癥介質(zhì)則表達(dá)得比較晚且半衰期較長，更為有利于臨床上觀察和針對(duì)性治療，在臨床治療中的前景或較大。HMGB1是膿毒癥時(shí)關(guān)鍵的晚期炎癥因子，也是導(dǎo)致膿毒癥時(shí)腸道黏膜層破壞的重要因素之一。Sappington 等［17］的研 究表 明，HMGB1 在膿毒癥發(fā)展過程中可以促使腸道黏膜屏障功能被破壞，而減少HMGB1在體內(nèi)的水平，可以顯著減輕腸道屏障功能被破壞的程度。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充外源性瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠的肝臟、心臟都有保護(hù)作用［7,18］，這可能與瓜氨酸對(duì)膿毒癥大鼠體內(nèi)多種炎癥因子有調(diào)節(jié)能力并能提高臟器組織的抗氧化能力有關(guān)。本次研究發(fā)現(xiàn)，瓜氨酸灌胃給藥能有效地減輕大鼠膿毒癥癥狀，減緩膿毒癥的發(fā)展速度，提示補(bǔ)充外源性瓜氨酸能有效控制膿毒癥時(shí)期大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。此外，瓜氨酸還有降低膿毒癥時(shí)期的關(guān)鍵晚期炎癥因子HMGB1的作用，并對(duì)大鼠腸道組織的炎癥細(xì)胞浸潤有良好的抑制作用，可較為顯著減輕大鼠腸道的炎癥反應(yīng)，保護(hù)大鼠的腸道，或因瓜氨酸抑制了HMGB1的表達(dá)，從而降低了腸道黏膜的損害、減輕了腸道組織的炎癥反應(yīng)。除此之外，血清中HMGB1含量的降低也一定程度上減輕了膿毒癥導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)，配合瓜氨酸對(duì)其他炎癥因子的調(diào)控［7］，可對(duì)處于膿毒癥時(shí)期的機(jī)體和體內(nèi)各器官起到了一定的保護(hù)作用。兩組CLP大鼠在各個(gè)時(shí)點(diǎn)的生存率并不存在差異，而本次研究數(shù)據(jù)僅基于各時(shí)點(diǎn)實(shí)測值，故未能進(jìn)一步分析累積生存率，為本研究不足之處。

基于本研究可認(rèn)為，補(bǔ)充外源性瓜氨酸可有效緩解大鼠的膿毒癥癥狀，降低大鼠結(jié)腸組織炎癥反應(yīng)，對(duì)膿毒癥時(shí)期的結(jié)腸起到了保護(hù)作用，同時(shí)也顯著降低了血清中晚期炎癥因子HMGB1的水平。

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