于亞敏,李 霞,唐國冬,楊繼紅,2,3*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 合陽葡萄示范站,陜西 合陽 715300)

釀酒酵母由于發(fā)酵力強(qiáng),酒精轉(zhuǎn)化率高,耐受高濃度的糖、乙醇、SO2等,而在酒精發(fā)酵過程中占據(jù)主導(dǎo)地位［1-2］。釀酒酵母是影響葡萄酒的香氣最重要的因素之一［3］。研究表明,釀酒酵母產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物能夠影響葡萄酒風(fēng)味［4］,且不同的菌株會有不同的影響［5］。李景明等［6-7］研究發(fā)現(xiàn),不同釀酒酵母單獨發(fā)酵的赤霞珠葡萄酒的主要香氣成分相同,但含量有顯著差異。

單一的商業(yè)釀酒酵母發(fā)酵使得葡萄酒的風(fēng)格和潛力趨于同質(zhì)化,為了使葡萄酒風(fēng)格的多樣化,科研工作者嘗試非釀酒酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵的研究［8-9］,而關(guān)于釀酒酵母混合發(fā)酵的研究報道較少。HOWELL K S等［10］通過代謝足跡法研究發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵的成品酒的香氣輪廓有別于單種釀酒酵母分別發(fā)酵后混合調(diào)配的葡萄酒香氣輪廓。SABERIS等［11］研究發(fā)現(xiàn)兩種勃艮第本土釀酒酵母混合發(fā)酵的霞多麗葡萄酒具有濃郁的甜果、草莓、青蘋果、梨和香蕉香氣,比其他6種商業(yè)釀酒酵母單獨釀制成品酒的香氣更為獨特和復(fù)雜。

釀酒酵母F15釀制的赤霞珠干紅葡萄酒香氣豐富,具有果香、油脂香、草香、酒香、花香,但花香、果香不突出［6,12］。釀酒酵母EC1118最初從香檳酒中分離得來,被廣泛應(yīng)用于干白葡萄酒、起泡葡萄酒、蘋果酒以及甜酒的釀制,具有花香、果香味濃郁的香氣特征［13］。本研究以釀酒酵母F15單獨發(fā)酵為對照,通過添加不同比例的釀酒酵母EC1118和F15混合發(fā)酵赤霞珠干紅葡萄酒,探討釀酒酵母EC1118與F15混合發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分的影響,以期為混合釀酒酵母發(fā)酵的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄原料：紅色釀酒品種赤霞珠,2015年10月采自陜西涇陽產(chǎn)區(qū)。原料糖度為210 g/kg(以葡萄糖計),酸度為7.90 g/kg(以酒石酸計)。

釀酒酵母EC1118：法國LALVIN公司；釀酒酵母F15：法國LAFFORT公司。

葡萄糖、無水乙酸鈉、氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、五水合硫酸銅、酒石酸鉀鈉(均為分析純)：廣東光華科技股份有限公司；亞硫酸溶液(含6%SO2)：陜西省礦物化工所；果膠酶(酶活4 400 U/g)、澄清劑(魚膠、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、膨潤土按一定比例混合)：法國LAFFORT公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TraceDSQ氣質(zhì)聯(lián)用(gaschromatograph-massspectrometer,GC-MS)儀：美國Thermo Finnigan公司；TurboMatrix 350熱解析儀：美國PerkinElmer公司；DB-Wax色譜柱(30 m×0.25mm×0.25μm)、UV-60紫外可見光分光光度計：美國安捷倫公司；聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)涂層覆蓋的攪拌棒(Twister)(10 mm×0.5 mm)：德國Gerstel公司；5804R臺式冷凍離心機(jī)：德國Eppendorf公司；XC-310 4℃醫(yī)用冷藏箱：澳柯瑪醫(yī)療器械有限公司；GC-17蒸餾裝置：鄭州中天實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霞珠干紅葡萄酒的釀造

釀造工藝［14］：取成熟度良好、果粒完整的赤霞珠葡萄共84 kg,等量分裝于12個10 L窄口玻璃發(fā)酵罐中,手工破碎,破碎度50%,留取適量的上清液測定葡萄汁的糖酸含量。破碎完畢,立即添加亞硫酸溶液,使SO2質(zhì)量濃度達(dá)到50mg/L。試驗設(shè)計目標(biāo)酒精度為13%vol,按照17.5g糖轉(zhuǎn)化為1%vol的酒精度進(jìn)行換算,補(bǔ)加蔗糖調(diào)整葡萄汁糖度至227.5 g/L。在添加亞硫酸溶液1 h后添加果膠酶20 mg/L。靜置24 h后,以釀酒酵母F15單獨發(fā)酵為對照,添加不同比例菌株EC1118和F15(1∶9、3∶7和5∶5)的經(jīng)活化的酵母共200 mg/L,啟動發(fā)酵,并控制發(fā)酵溫度為28℃。每天檢測3次發(fā)酵液的溫度、比質(zhì)量,待比質(zhì)量降至1.010時分離皮渣并輕微壓榨,混合自流汁和壓榨汁,繼續(xù)發(fā)酵至比質(zhì)量降至0.992～0.996并保持2 d恒定后,膨潤土下膠,24 h后分離清液,并立即添加亞硫酸溶液,使SO2質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/L,裝罐密封置于4℃冷庫貯藏3個月后,再裝瓶置于4℃冷庫貯藏3個月后測定各個指標(biāo)。

1.3.2 基本理化指標(biāo)的測定

還原糖和總糖(以葡萄糖計)：采用直接滴定法；總酸(以酒石酸計)和揮發(fā)酸(以醋酸計)：采用指示劑法；酒精度和干浸出物：采用密度瓶法。以上檢測方法均參照國標(biāo)GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》［15］中的方法進(jìn)行。試驗均重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.3.3 香氣成分測定

采用攪拌棒吸附萃取法(stir bar sorptive extraction,SBSE)提取赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分,具體方法參考李娜娜等［16］的方法。

TurboMatrix 350熱解吸儀分析條件：以氦氣(He)為載氣,脫附流速設(shè)為45 mL/min,加熱閥溫度設(shè)為245℃,脫附管溫度為270℃,脫附15 min；傳輸線溫度為255℃。冷阱捕集溫度設(shè)為-30℃,以40℃/min升至255℃(二級解吸冷阱溫度)；出口分流比為3∶1,進(jìn)樣He流速為1 mL/min。

GC條件：DB-WAX色譜柱(30 m×0.25mm,0.25μm)以氦氣(He)為載氣,流速設(shè)為1mL/min。升溫程序為40℃保持3min,以4℃/min升至160℃,7℃/min至230℃,保持8 min,連接桿溫度設(shè)為230℃。

MS條件：全掃描范圍為33～450 amu,每秒掃描1次。以電子電離(electron ionization,EI)為電離源,離子源溫度230℃,電子能量70eV,燈絲流量0.2mA,檢測器電壓350V。

定性定量：數(shù)據(jù)圖譜經(jīng)計算機(jī)圖譜軟件XcaLibur系統(tǒng)分析與美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(national instituteof standardsand technology,NIST)2005標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST Chemistry(http：//webbook.nist.gov/chemistry)相匹配,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留指數(shù)定性。以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物(質(zhì)量濃度1 170μg/L),采用內(nèi)加標(biāo)準(zhǔn)法定量計算各成分含量［6］,即檢出成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值,乘校正因子和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度,對于無標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的揮發(fā)性成分,計算時,采用與其化學(xué)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)的校正因子。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行計算,用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析(analysis of variance,ANOVA),多重比較(multiplecomparison,MC)和主成分分析(principal componentanalysis,PCA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母混合發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒理化指標(biāo)的影響

由表1可知,4組不同比例混合酵母所釀的葡萄酒的還原糖含量均＜2 g/L,發(fā)酵徹底,揮發(fā)酸含量均＜0.4 g/L,沒有發(fā)生破敗,總酸含量均在6.50 g/L左右,性質(zhì)穩(wěn)定；混合組的還原糖含量顯著低于對照組(P＜0.05),說明釀酒酵母混合發(fā)酵提高了葡萄汁中還原糖的利用率。各組的酒精度在13.10%vol～11.50%vol之間,其中菌株EC1118和F15比例為1∶9和3∶7組所釀葡萄酒的酒精度顯著高于對照組和5∶5組(P＜0.05),說明適宜比例的混合釀酒酵母發(fā)酵能夠提高酒精的轉(zhuǎn)化率,這與酵母EC1118有較強(qiáng)葡萄糖和果糖利用能力以及酒精生成能力的文獻(xiàn)報道相一致［13］。5∶5組所釀葡萄酒的還原糖、總糖含量和酒精度均較低,而干浸出物含量顯著的高于1∶9和3∶7組的,與對照組的差異不顯著。釀酒酵母EC1118和F15混合發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒基本理化指標(biāo)結(jié)果均符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15037—2006《葡萄酒》［17］,且比例為1∶9和3∶7時,酒精度顯著增高(P＜0.05)。

表1 混合釀酒酵母發(fā)酵釀制的赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indicators of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae

2.2 釀酒酵母混合發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒香氣成分的影響

通過GC-MS對4組不同比例混合酵母所釀葡萄酒的香氣物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析,共得到46種揮發(fā)性物質(zhì)(見表2),包含酯類物質(zhì)24種,醇類物質(zhì)7種,酸類物質(zhì)11種,酮類物質(zhì)3種,及烯烴類物質(zhì)1種。對照組和菌株EC1118和F15比例為3∶7組的香氣成分種類最多(均為40種),5∶5組的次之(33種),1∶9組的最少(27種)；3∶7組的香氣成分總量顯著高于其他組(P＜0.05)。在混合發(fā)酵過程中,酵母菌間會相互占有或者利用異己菌株分泌的中間代謝產(chǎn)物［10］,這使得本研究中混合組的香氣在種類上等于或者少于對照組,而含量上要多于對照組。因此,釀酒酵母EC1118和F15混合發(fā)酵會使得成品酒的香氣種類減少,含量增加,當(dāng)兩者混合比例為3∶7時,香氣含量增加的最多。

表2 釀酒酵母混合發(fā)酵釀制的赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分Table 2 Aroma components of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae μg/L

續(xù)表

酯類是葡萄酒中最重要的香氣物質(zhì)［1,21-22］。由表2可知,對照組的酯類物質(zhì)種類最多(21種),菌株EC1118與F15比例為3∶7組和5∶5組次之(18種、17種),1∶9組最少(14種)?；旌辖M的酯類物質(zhì)總量與對照組之間差異不顯著。3∶7組的酯類物質(zhì)總量顯著高于1∶9組和5∶5組(P＜0.05)。這與混合酵母發(fā)酵過程中,酵母的酯酶活性與接種順序、酵母的生長狀況有關(guān)［1］。3∶7組中的辛酸乙酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、己酸異戊酯、乙酸苯乙酯和3-苯丙酸乙酯的含量顯著高于其他組(P＜0.05)。

高級醇是酵母通過艾利希途徑(Ehrlich Pathway)產(chǎn)生的重要香氣物質(zhì)［23］,＜300 mg/L時賦予葡萄酒復(fù)雜感,＞400mg/L時會帶來不愉悅的風(fēng)味［24-25］。由表2可知,混合組的醇類物質(zhì)總量顯著高于對照組(P＜0.05),且含量均＜300mg/L。3∶7組的醇類物質(zhì)含量顯著高于其他組(P＜0.05),其1-壬醇和苯乙醇的含量顯著高于其他組(P＜0.05),其金合歡醇含量顯著高于對照組和5∶5組(P＜0.05),其具有玫瑰、菩提花香氣［19］。

有機(jī)酸是保持葡萄酒平衡的主要物質(zhì)［26-27］。由表2可知,3∶7組的酸類物質(zhì)總量顯著高于其他組(P＜0.05)。3∶7組中壬酸、十一烷酸、月桂酸和油酸的含量較低但顯著高于其他組(P＜0.05)。短鏈、中鏈脂肪酸通常會給葡萄酒香氣帶來負(fù)面影響,卻是合成酯類物質(zhì)的必不可少的前體物質(zhì)［28-29］。3∶7組的辛酸含量顯著高于對照組(P＜0.05)。1∶9組的肉豆蔻酸的含量顯著高于其他組(P＜0.05)。

4組成品酒香氣中的酮類含量和種類都較少,且總含量存在顯著差異(P＜0.05)。3∶7組的酮類物質(zhì)含量顯著高于其他組(P＜0.05),其大馬士酮的含量顯著高于其他組(P＜0.05),具有玫瑰花香、榅桲果香。僅在3∶7組中檢測到香葉基丙酮,其具有花香。而略有香味的角鯊烯在1∶9組中含量顯著高于3∶7組(P＜0.05)。4組香氣中,僅檢測出3種萜烯類香氣物質(zhì)——香葉醇、大馬士酮和香葉基丙酮。

綜上所述,釀酒酵母EC1118和F15混合發(fā)酵得到赤霞珠干紅葡萄酒的酯類、醇類和酸類等香氣物質(zhì)的含量均有所增加。當(dāng)兩者的混合比例為3∶7時,香氣的含量顯著高于其他組(P＜0.05),果香、花香成分增加的最多。

選取對4組成品酒香氣貢獻(xiàn)較大的26種香氣物質(zhì)的進(jìn)行主成分分析,結(jié)果見圖1。由圖1可知,提取出的前兩個主成分對整體方差的累計貢獻(xiàn)達(dá)到86.66%,PC1和PC2的貢獻(xiàn)分別為45.54%和42.12%。3∶7組處于在果香和花香香氣成分密集的區(qū)域,即丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等成分分布的PC1與PC2的正半軸區(qū)域。5∶5組分布在香氣成分較密集的區(qū)域,與異戊醇的分布接近,這可能與酵母菌株的BAT1基因的過表達(dá)有關(guān)［3］。對照組和1∶9組與大多的香氣成分的分布較為疏遠(yuǎn)。1∶9組與香葉醇和肉桂酸乙酯分布較近,對照組與乙酸異戊酯分布較近。由此可知,釀酒酵母EC1118和F15混合發(fā)酵對赤霞珠干紅葡萄酒中呈果香、花香的揮發(fā)類香氣物質(zhì)的影響較大,當(dāng)兩者的混合比例為3：7時,成品酒香氣種類最為密集、復(fù)雜,果香和花香更為濃郁突出,香氣質(zhì)量最佳。

圖1 混合釀酒酵母發(fā)酵的赤霞珠干紅葡萄酒的香氣成分主成分分析Fig.1 Principal component analysis of aroma components of Cabernet Sauvignon dry red wines produced by mixed fermentation of two kinds of Saccharomyces cerevisiae

3 結(jié)論

本研究以酵母F15單獨發(fā)酵為對照,添加不同比例的釀酒酵母EC1118和F15混合發(fā)酵得到赤霞珠干紅葡萄酒的理化指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn),酯類、醇類和酸類等香氣物質(zhì)的含量均有所增加。當(dāng)菌株EC1118與F11的混合比例為1∶9和3∶7時,葡萄酒中酒精度顯著增高(P＜0.05)；且當(dāng)二者比例為3∶7時,香氣成分總含量顯著高于其他組(P＜0.05),果香、花香香氣成分聚集。本研究為釀酒酵母混合發(fā)酵的開發(fā)和利用提供了參考。

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