李世瑞,蔣立文*,周金沙,陳則典

(1.湖南農業(yè)大學 食品科學技術學院,湖南 長沙 410128；2.食品科學與生物技術湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410128；3.湖南省食品安全生產工程技術研究中心,湖南 長沙 410013；4.湖南和品茶業(yè)有限公司,湖南 長沙 410127)

湖南安化黑茶屬于后發(fā)酵茶,茯磚茶屬于黑茶中的高檔茶類之一。目前黑茶保健作用及冠突散囊菌代謝特征是研究的熱點。研究表明［1-3］,安化黑茶品質的形成與加工過程中的微生物作用息息相關,微生物對安化黑茶品質和風味的形成發(fā)揮了重要的作用。茯磚茶加工中的“發(fā)花”過程是茯磚茶獨特品質的關鍵發(fā)酵工藝［4-7］。發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物冠突散囊菌又名“金花”菌,“發(fā)花”的實質是通過控制一定的溫濕度條件,促使優(yōu)勢菌——冠突散囊菌生長繁殖產生的金黃色閉囊殼［8-10］,它在茯磚茶中的含量與茶葉滋味、香氣、保健作用等密切相關［11-12］。曾斌等［13-15］對茯磚茶“發(fā)花”過程中優(yōu)勢微生物及其生物學特性、代謝產物進行系統(tǒng)研究,“發(fā)花”過程中“金花”菌的數量是作為黑茶品質好壞的判斷標準之一。盡管目前關于茯磚茶中冠突散囊菌的分析篩選文獻較多,但對某一個分離菌株進行系統(tǒng)研究的較少。

本研究在周揚艷等［16］對獲磚茶中優(yōu)勢微生物在不同培養(yǎng)基的差異性比較的基礎上對分離所得到的微生物進行鑒定,同時比較3種培養(yǎng)基對黑茶優(yōu)勢微生物培養(yǎng)菌落形態(tài)差異,并利用蛋白質質譜對冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)進行初步分析,研究菌種蛋白質本身的相關指標,期待深入解析其作用,為更好研究純種“金花”特性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2008年金花茯磚：益陽安化茶廠。

1.1.2 試劑

生理鹽水(0.8%)：實驗室自行配制；2×Mix,內轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)引物：由鼎國公司合成。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基［18］

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(編號為A)：馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

CZG培養(yǎng)基(編號為B)：蔗糖40g,NH4NO30.3g,K2HPO40.1g,MgSO4·7H2O0.05g,NaCl14g,瓊脂3g,蒸餾水100mL,pH自然。

40%蔗糖麥芽浸膏瓊脂(M40Y Agar,M40Y)培養(yǎng)基(編號為C)：蔗糖400.0 g,麥芽提取物20.0 g,酵母提取物5.0 g,瓊脂粉20.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

氯硝胺18%甘油瓊脂(dichloran glycerol agar,DG18)培養(yǎng)基(編號為D)：葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,KH2PO41.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,二氯硝基苯胺2.0 mg,1.0%氯霉素溶液10.0 mL,蒸餾水1 000 mL,pH自然。

1.2 儀器與設備

TP-620A電子天平：湘儀天平設備有限公司；101-2AB型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；SW-CJ系列超凈工作臺：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：海申安醫(yī)療器械廠；MJ-250B5-II霉菌培養(yǎng)箱：上海璽恒實業(yè)有限公司；DL9700基因擴增聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction PCR)儀：東林昌盛有限公司；TMC恒溫孵育器：鼎國昌盛有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌落及細胞形態(tài)特征觀察

制備茶葉菌懸液,采用混合平板接種培養(yǎng),采用PDA培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。分別吸取10-4、10-5菌懸液1 mL至無菌平皿中,并對應倒入已冷卻至45～50℃的PDA培養(yǎng)基(每種培養(yǎng)基中每個稀釋梯度做3個重復),冷凝后倒置于28℃恒溫生化培養(yǎng)箱中進行黑暗培養(yǎng)。獲得生長速度快、菌絲致密、孢子量多的單個菌落,繼續(xù)進行多次點種培養(yǎng),獲得純菌落后轉接入斜面培養(yǎng)28℃/72 h。同時以無菌操作PDA點種后觀察菌落形態(tài),利用光學顯微試驗觀察子囊果的情況。

1.3.2 分子生物學鑒定步驟

(1)菌株基因組的提取：參照文獻［17］進行。

(2)目的片段擴增和產物回收：合成引物的序列：ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；反應體系：2×Mix 25μL；ITS1(10μmol/L)1μL；ITS4(10μmol/L)1μL；DNA模板2μL；添加dd H2O至50μL。擴增反應條件：預變性94℃/5 min；變性94℃/30 s；退火54℃/30 s；延伸72℃/50 s,變性、退火、延伸三個步驟進行35次循環(huán)；延伸72℃/10 min。

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,利用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物,Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

(3)測序及其結果BLAST比對：將PCR產物送至鼎國公司進行純化和測序,將測序得到的序列提交到Genbank數據庫(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/),通過BLAST同源性比對分析,找到同源性高的菌種并構建進化樹。

(4)利用DNAstar構建系統(tǒng)發(fā)育樹：以5.8SrDNA的ITS序列同源性＞99%為標準進行屬種歸類。然后再對測試菌株利用DNAstar軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,進一步進行種屬鑒定。

1.3.3 冠突散囊菌在A、B、C、D特異性培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)

將分離得到的純菌株制成一定濃度的孢子懸浮液,采用混合培養(yǎng)法,分別記錄該菌株在A、B、C、D培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)9 d、18 d后的表征進行描述,如菌落密集程度、菌體顏色、培養(yǎng)基的正反面著色情況等,進行差異性描述。

1.3.4 蛋白質全譜的測定

(1)蛋白提?。簩⒎蛛x純化的純種斜面收集培養(yǎng)物,用200μL0.06mol/L的溴化四乙胺(tetraethylammoniumbromide TEAB),用超聲破碎儀進行破碎,加入4倍體積的冷丙酮(-20℃預冷,含終濃度為10mol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT))沉淀2 h,13 000 r/min離心20 min,收集沉淀；加入800μL的冷丙酮(含終濃度為10 mol/L DTT)重懸沉淀；13 000 r/min離心20 min,收集沉淀,然后液氮吹干沉淀,加入100μL的TEAB溶解蛋白；(2)蛋白質定量：采用Bradford法定量；(3)蛋白質的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)(10%SDS 30%AGE)檢測、酶切、標記；(4)除鹽：將標記過程中的標記試劑和相關緩沖液中的鹽除去,以便于后續(xù)分析；(5)等量混合各樣本中的標記肽段；(6)MS/MS質譜檢測及分析；(7)生物信息分析。上述結果測定在杭州聯(lián)川生物信息技術有限公司完成。

1.3.5 微生物蛋白質全譜的分析

Uniprot/Mucor(包含23827條蛋白質序列)(更新于2016年3月)數據庫。采用與AB Sciex 5600 plus配套的搜索引擎——ProteinPilot v4.5進行數據解析。微生物蛋白質全譜分析的數據庫選擇遵循如下原則：若為已經測序的生物,直接選用該物種數據庫,若為非測序生物,則選擇與被測樣品最為相關的大類蛋白質組數據庫。

2 結果與分析

2.1 菌落的形態(tài)特征

采用混合培養(yǎng)法得到的純種在PDA平皿上生長菌落為較規(guī)則的圓形,呈亮麗的金黃色,菌落中間的顏色較四周深且略偏褐色,菌落的外周圍明顯可見白色菌絲(見圖1A)。利用光學顯微鏡可以明顯看到能清楚看到子囊果(見圖1B)及釋放子囊果(見圖1C)。

圖1 分離微生物的菌落形態(tài)及子囊果特征Fig.1 Colony morphology and ascocarp characteristics of the isolated microorganisms

2.2 分子生物學鑒定

將純化菌株送至北京鼎國昌盛生物有限公司檢測,得到PCR擴增電泳圖(見圖2),可知擴增后的分子質量約為500 bp。把菌株的ITS序列片段通過BLAST程序在GenBank上進行相似性檢索,構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果見圖3。結果表明,菌株strain2-seq與數據庫中的冠突散囊菌具有99%的相似性,說明此菌株為冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。

圖2 菌株的ITS區(qū)域PCR擴增結果Fig.2 Results of PCR amplification of strain ITS region

圖3 基于5.8S rDNA序列鑒定菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 5.8S rDNA sequence analysis

2.3 冠突散囊菌在不同培養(yǎng)基的菌落表征比較

采用混合培養(yǎng)法將分離菌株strain2-seq接種到不同培養(yǎng)基28℃恒溫培養(yǎng),并比較9 d、18 d時培養(yǎng)基兩面的菌落生長情況,結果見表1。

由表1可知,在培養(yǎng)基A上培養(yǎng)9d菌落內部褐色周邊淡黃色；培養(yǎng)18 d菌落大部分呈較深的黑褐色,菌落外周圍有明顯的棕黃色暈圈,較干燥,具明顯自溶現(xiàn)象,正反面特征相近。在培養(yǎng)基B上培養(yǎng)9 d具亮麗的金黃色,菌落中部呈土黃色稍突起,形狀較規(guī)則、絲絨狀、菌落較厚；培養(yǎng)18 d菌落近于橙黃色,周圍呈紅色,其他為黃色,反面呈血紅色,周圍為棕黃色。在培養(yǎng)基C上培養(yǎng)9 d菌落中心為橄欖褐與橄欖綠相間,外周圍為偏暗的橙黃色,菌落周圍為黃褐色,空白處為金黃色,菌落背面中間為深褐色,外四周為暗紅色,培養(yǎng)基為金黃色；培養(yǎng)18 d菌落呈較深的橙紅色,菌落為橄欖綠、橄欖褐、橙黃色相間,菌落背面為棕褐色,且菌落周圍培養(yǎng)基較空白處色彩加深,菌落較周圍突起、致密。在培養(yǎng)基D上培養(yǎng)9 d菌落最外層為亮麗的金黃色,個別菌落為橙黃色,同時可觀察到部分菌落上的滲出液有消去的跡象,使菌落較之前為平坦,呈青灰色,邊緣為棕黃色,菌落背面呈黑褐色,邊緣為較深的暗紅色,培養(yǎng)基的正反面為紅褐色,部分空白處為金黃色,菌落密集,菌落中心有黑色滲出液,呈油狀、濃而黏稠、具有光澤；培養(yǎng)18 d后,滲出液愈加濃稠,部分已基本消失,使得菌落干燥,中心凹陷,較不平整,呈較深的棕黃色,菌落背面為棕黑色,培養(yǎng)基的正反面呈較深的暗紅色。

表1 從茯磚茶中獲得主要微生物不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的形態(tài)表征圖Table 1 Morphological characterization of the main microorganisms from Fuzhuan brick tea separated by different media

綜上比較分析,冠突散囊菌在四種培養(yǎng)基上的生長速度差異較大,形成的孢子顏色和分泌色素差異較大,同時發(fā)現(xiàn)該菌培養(yǎng)時間達到18 d,且在培養(yǎng)過程中完全依賴了培養(yǎng)基本身水分,這說明在不同培養(yǎng)基中該菌顯示不同的生長特性,同時能夠在14%鹽度和40%蔗糖含量條件下生長,體現(xiàn)了較強的耐干性和耐滲透性,這也為茯磚茶在長期存放過程金花菌可以繼續(xù)生長提供了科學依據,但表征差異性是否會影響到代謝性能變化有待探索。

2.4 菌株的蛋白質及質譜分析鑒定結果統(tǒng)計

采用基于質譜方法的蛋白質組鑒定基本流程,即對MS/MS質譜數據經過系列優(yōu)化處理后與數據庫進行相似性比較打分從而進行蛋白鑒定。質譜產生的二級譜圖數、解析的二級譜圖數以及鑒定到的肽段數和蛋白數總體情況見表2。

表2 冠突散囊菌蛋白質鑒定結果Table 2 Identification results of protein from E.cristatum

2.4.1 Unique肽段數分布

Unique肽段指每個蛋白或者蛋白家族特有的多肽序列,即僅在一個蛋白質中存在的肽段。由這類型肽段的存在,可以唯一地確定相應蛋白質的存在。樣品中鑒定到的包含所有蛋白的95%可信度Unique肽段數的雙坐標分布結果見圖4。

圖4 冠突散囊菌中鑒定蛋白中的Unique肽段數分布Fig.4 Unique peptide distribution of identified proteins in E.cristatum

由圖4可知,供試樣品鑒定結果中,至少含有Unique-2肽段的蛋白質占總蛋白質的73.34%,數目為1373個。Unique肽段是蛋白質所特有的、能夠將其與其他蛋白質特異性區(qū)分的肽段序列,即該菌獨有的肽段,在至少含有Unique-2肽段在鑒定比例達到70%以上,說明其獨特性,這為進一步研究的不同冠突散囊菌本身蛋白特性及不同來源的冠突散囊菌發(fā)酵差異性分析提供了依據。

2.4.2 肽段長度分布

在樣品蛋白質足量的情況下,利用質譜儀鑒定到肽段的長度分布結果見圖5。由圖5可知,樣品鑒定到肽段的長度為12個的肽段最多,肽段長度區(qū)域在8～22個之間,平均肽段長度為15.05個。若鑒定到的肽段偏高或者偏低,則說明實驗階段選擇使用的酶不恰當,使得酶切肽段大部分高于或者低于質譜儀的檢測范圍,從而使得可檢測肽段偏少,鑒定蛋白數目降低。本次鑒定在肽段長度11、12鑒定到肽段主峰,介于全部的的鑒定范圍中值,保證鑒定到足夠多的蛋白。

圖5 冠突散囊菌菌體蛋白質種肽段長度分布Fig.5 Peptide segment length distribution of E.cristatum

2.4.3 蛋白覆蓋度分布

樣品中蛋白質鑒定(95%可信度肽段)覆蓋度分布餅圖見圖6。由圖6可知,供試樣品鑒定覆蓋度≥20%的蛋白質百分比為30.93%,覆蓋度在［0～10%］范圍內的蛋白占總蛋白的43.27%,平均蛋白質的鑒定覆蓋度為16.33%。蛋白鑒定主要是鑒定Unique肽段(Unique肽段指每個蛋白或者蛋白家族特有的多肽序列),而Unique肽段占蛋白質全長的比例較低,說明該菌株個體的差異性,間接說明此數據具有一定的可信度。

圖6 冠突散囊菌蛋白鑒定覆蓋度的整體分布Fig.6 Overall distribution of identification coverage of protein in E.cristatum

3 結論

根據菌落形態(tài)特征分析、顯微鏡鏡檢分析及分子生物學鑒定,結果表明所獲得的菌株為冠突散囊菌(Eurotium cristatum)。從“金花”菌的表征形態(tài)差異來看,其呈現(xiàn)的差異性體現(xiàn)在其耐高滲、高鹽的生長特性,但在實驗室或實際生產中到底培養(yǎng)多長時間合適或保存不同時間對發(fā)酵性能有何影響等諸多方面,在以后的研究中還需進一步研究和關注。

從菌體蛋白質質譜分析來看,由于沒有相關數據比較,無法直接說明比較其作用相關特性。以上這些分析數據只針對這一分離得到的純種冠突散囊菌得到的數據,若需要詳細分析有待尋找標準菌株來進行對照,還需要對更多的樣本進行比較,以確定最終的標準菌株。從目前中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心登記的冠突散囊菌僅14種,其具體差異性不清楚。在以后研究中將宏基因組學、蛋白組學、代謝組學等相結合,研究該菌在黑茶發(fā)酵過程中酶系形成與物質轉化、功能關系聯(lián)系起來,該菌中廣泛存在的次級代謝產物資源還可能被繼續(xù)挖掘和利用,為發(fā)酵黑茶功能多樣性分析奠定基礎。

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