羅沖，張向東，吳艷林，王新偉

（河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院 1.消化內(nèi)科，2.腫瘤內(nèi)科，3.普外科，河南 南陽(yáng) 473009）

結(jié)直腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，盡管大多數(shù)患者可及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的手術(shù)治療，但其淋巴轉(zhuǎn)移依然是術(shù)后復(fù)發(fā)以及影響患者生存的一個(gè)重要因素[1-2]，對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移及其相關(guān)機(jī)制的研究具有重要的臨床意義。細(xì)胞的黏附反應(yīng)作為腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)距臟器轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-5]，近年來(lái)成為研究者專注的重要課題之一。整合素（Integrins）是細(xì)胞黏附分子家族的重要一員，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附反應(yīng)，從而影響細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)特性[6-7]。整合素β1（Integrin β1）則是該家族最大的亞群，已被報(bào)道在多種腫瘤中異常表達(dá)，如頭頸部腫瘤、食管鱗癌、乳腺癌等[8-10]。基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metallopmteinase-9，MMP-9）則屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）超家族中的明膠酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，廣泛參與腫瘤、炎癥、心血管系統(tǒng)等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)[11-13]細(xì)胞外基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的基本步驟，包括胃癌、宮頸鱗癌、淋巴瘤腫瘤中出現(xiàn)MMPs家族的異常表達(dá)。但對(duì)于Integrin β1及MMP-9與結(jié)直腸癌臨床關(guān)系的系統(tǒng)性研究報(bào)道甚少。本文通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中Integrin β1及MMP-9蛋白的分布和表達(dá)情況探討其與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及臨床分期的關(guān)系，分析其臨床意義，并于術(shù)后對(duì)患者進(jìn)行隨訪，初步評(píng)價(jià)Integrin β1及MMP-9的表達(dá)與臨床療效之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2008年3月-2011年3月于南陽(yáng)市中心醫(yī)院確診為結(jié)直腸癌的52例患者的病理標(biāo)本及31例正常腸黏膜組織標(biāo)本。所有入選病例均經(jīng)患者知情同意且入院之前未接受過(guò)放、化療或手術(shù)治療。其中，男性37例，女性15例；年齡21～67歲，平均53歲；病程2～4年，平均2.6年。依據(jù)患者具體情況進(jìn)行相應(yīng)治療后保存患者的癌組織切片，同時(shí)詳細(xì)錄入其臨床病理資料，以備后續(xù)分析。另收集癌旁配對(duì)組織標(biāo)本42例及31例非腸癌患者的正常腸黏膜組織標(biāo)本作對(duì)照研究。

納入患者均在接受相應(yīng)的治療之后參與隨訪調(diào)查，其中失訪2例。隨訪1年后死亡6例，隨訪3年后死亡14例，隨訪5年后死亡29例。其中27例死于腫瘤術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，2例死于其他疾病。

1.2 免疫組織化學(xué)鏈霉親和素過(guò)氧化物酶連接方法（Immunohistochemical SP）

將癌組織標(biāo)本、癌旁配對(duì)組織標(biāo)本及正常腸黏膜組織標(biāo)本用10%甲醛浸泡固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋后冷凍切片，免疫組織化學(xué)染色方法參照SP試劑盒（購(gòu)自北京中杉金橋生物公司）的說(shuō)明書進(jìn)行操作。鼠抗人Integrin β1單克隆抗體及鼠抗人MMP-9單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，磷酸鹽緩沖液PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定，Integrin β1和MMP-9均以細(xì)胞膜和/或胞質(zhì)著棕黃色顆粒為陽(yáng)性[7]。參考文獻(xiàn)[8]的半定量方法評(píng)定染色結(jié)果，即根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分：①染色強(qiáng)度的記分標(biāo)準(zhǔn)，不著色記0分、輕度著色（略強(qiáng)于陰性對(duì)照，表現(xiàn)為淡黃色顆粒）記1分、中度著色記2分、重度著色記3分；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的記分標(biāo)準(zhǔn)，＜10%的細(xì)胞著色記1分、10%～50%的細(xì)胞著色記2分、＞50%的細(xì)胞著色記3分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)或校正χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用χ2分割法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.0167，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，采用乘積極限法（Kaplan-Meier Method）分析生存率，采用Logrank法檢驗(yàn)生存分析差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Integrin β1和MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)

免疫組織化學(xué)SP法染色結(jié)果顯示在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織以及正常腸黏膜組織的細(xì)胞膜和/或胞質(zhì)中均可見黃色著色顆粒（見圖1），說(shuō)明Integrin β1和MMP-9在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常腸黏膜組織中均有表達(dá)。Integrin β1蛋白在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織和正常腸黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.69%、14.29%及6.45%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MMP-9在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常腸黏膜組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.77%、16.67%及9.68%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表 1）。Integrin β1和MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系經(jīng)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，Integrin β1和MMP-9蛋白的表達(dá)與肝轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)（P＜0.05）（見表 2）。

2.2 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)與術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系

本實(shí)驗(yàn)隨訪期限為5年，其中失訪2例。在結(jié)直腸癌組織中，Integrin β1表達(dá)陽(yáng)性組的平均生存時(shí)間為（32.34±1.93）個(gè)月，Integrin β1表達(dá)陰性組的平均生存時(shí)間為（53.5±1.3）個(gè)月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）（見圖2）。MMP-9表達(dá)陽(yáng)性組的平均生存時(shí)間為（30.05±2.17）個(gè)月，MMP-9表達(dá)陰性組的平均生存時(shí)間為（49.31±1.19）個(gè)月，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.004）（見圖3）。

2.3 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)與術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

對(duì)52例患者進(jìn)行隨訪的過(guò)程中，失訪2例，2例死于其他疾病，48例納入考察。發(fā)現(xiàn)有27例患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中5例再次進(jìn)行手術(shù)。術(shù)后復(fù)發(fā)情況與Integrin β1和MMP-9 2種蛋白表達(dá)水平的關(guān)系見表3，Integrin β1表達(dá)陽(yáng)性組的復(fù)發(fā)率高于陰性組，MMP-9表達(dá)陽(yáng)性組的復(fù)發(fā)率同樣高于陰性組。

2.4 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

Integrin β1和MMP-9 2種蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.981，P=0.001）。見表 4。

圖1 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)結(jié)果 （免疫組織化學(xué)SP法染色×400）

表1 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)

表2 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)和結(jié)直腸癌患者臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系

圖2 結(jié)直腸癌組織中Integrin β1對(duì)患者術(shù)后生存時(shí)間的影響

圖3 結(jié)直腸癌組織中MMP-9對(duì)患者術(shù)后生存時(shí)間的影響

表3 結(jié)直腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)與Integrin β1和MMP-9表達(dá)水平的關(guān)系

表4 Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

惡性腫瘤的一個(gè)重要生物學(xué)特性即是其極強(qiáng)的侵襲遷移能力，該能力不僅關(guān)系著患者的臨床治療效果及預(yù)后，還是患者術(shù)后復(fù)發(fā)及生存率下降的主要原因。結(jié)直腸癌作為一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，其侵襲遷移過(guò)程也是研究者們關(guān)注的重點(diǎn)之一。結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)距臟器轉(zhuǎn)移及侵襲是一個(gè)多因素共同參與的復(fù)雜過(guò)程，其中細(xì)胞的黏附是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)對(duì)52例結(jié)直腸癌患者的病理標(biāo)本、42例癌旁組織標(biāo)本及31例非腸癌患者正常腸黏膜組織標(biāo)本的對(duì)照研究，分析與細(xì)胞黏附密切相關(guān)的2個(gè)因子Integrin β1和MMP-9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，Integrin β1和MMP-9蛋白在結(jié)直腸癌患者的病理組織中表達(dá)高于癌旁組織及正常腸黏膜組織，證實(shí)Integrin β1和MMP-9蛋白的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生有密切的關(guān)系。同時(shí)對(duì)患者的臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示Integrin β1和MMP-9的表達(dá)與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移和Dukes分期相關(guān)。Integrin β1蛋白的表達(dá)對(duì)判斷結(jié)直腸癌的病理進(jìn)程和分期具有重要的參考意義，Integrin β1和MMP-9可作為新的衡量結(jié)直腸癌病理進(jìn)程及轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物。

此外本研究還分析了患者的5年生存情況及術(shù)后復(fù)發(fā)情況與這2種蛋白之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Integrin β1和MMP-9陽(yáng)性表達(dá)組的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高于陰性組，且5年術(shù)后生存時(shí)間明顯縮短，不利于患者預(yù)后。MMP-9屬于基質(zhì)MMPs超家族的一員，大量的研究均證實(shí)MMPs表達(dá)增強(qiáng)或活性增加可導(dǎo)致結(jié)直腸癌的不良預(yù)后[14-15]，與本研究結(jié)果具有一致性。MMP-9的表達(dá)受多種調(diào)節(jié)因子的影響，有研究表明[16]，整合素家族中Integrin αvβ3可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的分泌，誘導(dǎo)MMPs的激活，參與腫瘤的侵襲遷移。本研究分析結(jié)直腸癌中Integrin β1和MMP-9蛋白表達(dá)的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者的表達(dá)呈正相關(guān)，提示Integrin β1和MMP-9在結(jié)直腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中具有協(xié)同作用，但是兩者參與調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，Integrin β1及MMP-9在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，兩者皆與結(jié)直腸癌的病理特征和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時(shí)影響結(jié)直腸癌患者的術(shù)后復(fù)發(fā)及生存，此外在結(jié)直腸癌發(fā)病的過(guò)程中兩者的高表達(dá)可能具有協(xié)同作用，所以Integrin β1及MMP-9可以作為今后治療和預(yù)后結(jié)直腸癌的新靶點(diǎn)。

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