張亞杰　楊鵬　王旭　張兵帥　李莉　曹文正

摘要：目的：研究保真湯抗結(jié)核的作用機(jī)制。方法：將保真湯含藥血清作用于卡介苗活化的人單核-巨噬細(xì)胞U937，利用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12的含量。結(jié)果：與空白對(duì)照組相比，只有保真湯組高劑量組IL-12分泌量顯著增多（p<0.05），卡介苗作用組有IL-12分泌量減少的趨勢(shì)（P>0.05），保真湯中低劑量組與空白組相比IL-12分泌量差別不大；與卡介苗作用組相比，保真湯組高劑量組細(xì)胞IL-12分泌量顯著增多（P<0.05），保真湯中低劑量組亦有使其分泌量增多的趨勢(shì)。結(jié)論：保真湯通過增加巨噬細(xì)胞的IL-12分泌量，這可能是保真湯抗結(jié)核的作用機(jī)制的一部分。

關(guān)鍵詞：保真湯；卡介苗；IL-12

中圖分類號(hào)：R186+.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2018）10-0061-02

機(jī)體感染結(jié)核分支桿菌時(shí)，首先激活巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞把結(jié)核分枝桿菌固定于巨噬細(xì)胞表面；吞噬溶酶體溶解病原體；殺傷細(xì)菌或抑制其生長(zhǎng)；吸引、募集其他的免疫細(xì)胞到達(dá)炎癥發(fā)生部位并且把抗原提呈給T細(xì)胞激發(fā)獲得性免疫[1]，進(jìn)一步清除細(xì)菌，因此巨噬細(xì)胞在清除結(jié)核分支桿菌的過程中起至關(guān)重要的作用。

保真湯出自我國(guó)現(xiàn)存治療肺癆的專書《十藥神書》，為治療肺癆的傳統(tǒng)有效方，目前在臨床上治療肺結(jié)核也有很多成功的報(bào)道，所以本研究以保真湯含藥血清作用于卡介苗（卡介苗）活化的單核-巨噬細(xì)胞，通過檢測(cè)細(xì)胞因子IL-12分泌量的變化，初探保真湯治療結(jié)核病的作用機(jī)制。

一、材料

1.動(dòng)物和細(xì)胞：新西蘭白兔雄性，體重2.0±0.2kg，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（吉）-2016-0004。人單核-巨噬細(xì)胞U937，轉(zhuǎn)引自長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)免疫實(shí)驗(yàn)室。

2.藥品與試劑：皮內(nèi)注射卡介苗（上海生物制品研究所，50mg/只）；佛波酯（PMA）（Promega公司）；RPMI1640培養(yǎng)基、新生牛血清、胰酶（均購自Gibco公司）；Human IL-12 ELISA試劑盒（eBioscience公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.保真湯的制備：取當(dāng)歸人參、生地黃、熟地黃、白術(shù)、黃芪各100g；赤茯苓、白茯苓、陳皮、厚樸各75g；麥門冬、赤芍藥1、白芍藥、知母、黃柏、五味子、柴胡、地骨皮各100g；甘草50g，天門冬100錢，常規(guī)煎煮后，濃縮液為2g生藥/ml、4g生藥/ml、8g生藥/ml，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

2.家兔含藥血清的制備：將白兔隨機(jī)分為空白對(duì)照、保真湯高劑量組、保真湯中劑量組、保真湯低劑量組，每組5只。每組動(dòng)物分別給予相同體積的藥物10mL/kg，每日1次，空白對(duì)照組灌服等量生理鹽水，每日一次，灌胃4d。于最后一次灌胃后1h心臟采血（最后一次給藥前禁食不禁水12h），常規(guī)分離血清，同組動(dòng)物血清混勻，56℃滅活30min后，經(jīng)0.22μm，微孔濾膜過濾除菌，分裝后置于-20℃冰箱內(nèi)備用。

3.細(xì)胞傳代培養(yǎng)：將細(xì)胞接種于含10%滅活新生小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基溶液中，放入37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2×106/mL時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，使細(xì)胞密度維持在1×105/mL—2×106/mL。離心獲取傳代6次后，密度達(dá)5×105/mL的U937細(xì)胞，使用預(yù)溫的RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，加入10ng/mL的佛波酯（PMA），混勻后接種細(xì)胞懸液到12孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，再置于37℃、5%CO2、細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h?？梢娂?xì)胞伸出偽足，貼壁生長(zhǎng)。用預(yù)溫的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)板，使未貼壁的細(xì)胞去除。經(jīng)PMA處理后的貼壁細(xì)胞放在不含PMA及血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用在下一步實(shí)驗(yàn)。

4.卡介苗作用于巨噬細(xì)胞：取已培養(yǎng)24h的巨噬細(xì)胞，將其分為5組：空白對(duì)照組、卡介苗作用組、保真湯高劑量組、保真湯中劑量組、保真湯低劑量組，每組3復(fù)孔。經(jīng)含藥血清作用24h后（空白對(duì)照組、卡介苗作用組使用空白血清），于各組細(xì)胞除空白對(duì)照組外培養(yǎng)液中加入卡介苗混懸液，使其終濃度為0.125mg/ml，空白對(duì)照組加入等量RPMI1640培養(yǎng)液。

5.IL-12分泌量測(cè)定K：收集經(jīng)卡介苗作用24小時(shí)后細(xì)胞培養(yǎng)上清，以ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞IL-12。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組相比，只有保真湯組高劑量組IL-12分泌量顯著增多（p<0.05），卡介苗作用組有IL-12分泌量減少的趨勢(shì)（P>0.05），保真湯中低劑量組與空白組相比IL-12分泌量差別不大；與卡介苗作用組相比，保真湯組高劑量組細(xì)胞IL-12分泌量顯著增多（P<0.05），保真湯中低劑量組亦有使其分泌量增多的趨勢(shì)。

四、討論

巨噬細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起到很重要的效應(yīng)器作用，在結(jié)核分枝桿菌和其他細(xì)胞因子的刺激下，能夠產(chǎn)生很多細(xì)胞因子，如：IFN-γ，IL-10，IL-12、IL-23[2]等，其中IL-12能夠誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，抑制IL-4的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)1型細(xì)胞因子和2型細(xì)胞因子之間的平衡，這對(duì)于幼稚性T細(xì)胞向Thl分化是十分重要的[3]。本研究結(jié)果顯示保真湯高劑量組可使巨噬細(xì)胞IL-12分泌量增加，所以可以推測(cè)保真湯通過增加巨噬細(xì)胞的IL-12分泌量，從而增強(qiáng)了天然免疫和特異性免疫之間的聯(lián)系，這可能是保真湯抗結(jié)核的作用機(jī)制的一部分。

參考文獻(xiàn)：

[1]Alamelu Raja.Immunology of tuberculosis [J]. Indian Med Res120，2004：213-232.

[2]Verreck FA，DeBoer T， Langenberg DM，et al. Human IL-23 producing type 1 macrophages promote but IL-10 producing type 2 macrophages subvert immunity to （myco） bacteria[J] .Proc Natl Acad Sci USA，2004，107（13）：4560-4565

[3]陳敬，董德瓊，楊渝潔，等.白細(xì)胞介素12對(duì)結(jié)核病患者TH-1/TH-2平衡的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25（5）：292-295