， ，，

(1.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.紹興文理學(xué)院 元培學(xué)院，浙江 紹興 312000；3.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；4.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；5.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023)

食用植物酵素(Edible Plant Jiaosu)[1-6]是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料，加(或不加)糖類物質(zhì)，在較低溫度下，經(jīng)多種有益菌通過較長時間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，擁有豐富的代謝產(chǎn)物功能成分、植物本身營養(yǎng)成分和益生菌本身功能成分等，特別是富有小分子功能成分.研究表明：該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、凈化血液、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及解毒抗癌等多種保健功能.

火龍果營養(yǎng)豐富，富含多酚、黃酮、維生素、膳食纖維、蛋白質(zhì)和各種微量元素等，還含有一般水果少有的植物性白蛋白和特有的花青素成分，屬于高維生素、低糖、低脂的“一高兩低”功能食品[7].目前，針對火龍果酵素的研究報道極少，已有的研究報道主要集中在火龍果酵素產(chǎn)品的抗氧化活性和原花青素的測定方面[8-9].筆者跟蹤檢測了火龍果酵素發(fā)酵過程中pH值、總多酚含量變化以及抗氧化活性等指標(biāo)的變化，并對不同發(fā)酵時間的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析，旨在為火龍果酵素的發(fā)酵和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供科學(xué)指導(dǎo)和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅心火龍果，浙江省嘉興市桐鄉(xiāng)殷家漾村漾漾紅果業(yè)專業(yè)合作社；白糖，太古優(yōu)級白砂糖；酵液，浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制.

沒食子酸、磷酸二氫鉀、ABTS、三氯乙酸、鐵氰化鉀和三氯化鐵等(以上均為分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚(分析純)，上海長哲生物科技有限公司；過硫酸鉀(分析純)，西隴化工股份有限公司.

1.2 儀器設(shè)備

XW-80A型微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；PHS-3C型精密酸度計(jì)，杭州齊威儀器有限公司；Allegra X-12R型冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；UV-5500PC型紫外分光光度計(jì)，上海市元析儀器有限公司；PTX-FA210型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司.

1. 3 方 法

1.3.1 火龍果酵素制備

摘取無腐爛的新鮮火龍果，清洗，干燥脫去表面水分，切塊后按照質(zhì)量比1∶1的比例與白砂糖混合，加入適量酵素菌液，密封，15～25 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，適當(dāng)時間進(jìn)行放氣、攪拌、觀測.取樣時，開啟發(fā)酵罐攪拌裝置進(jìn)行充分混合，然后取樣，樣品經(jīng)10 000 r/min離心10 min后取上清液用于測定.

1.3.2 發(fā)酵過程中總多酚含量變化

參照GB/T 31740.2——2015茶多酚[10]的檢測方法，以沒食子酸為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.3 發(fā)酵過程中抗氧化能力變化

1) ABTS自由基清除能力.參照Nikolaos[11]的方法，略作改動.稱取6.62 mg過硫酸鉀和38.41 mg ABTS，用PBS(5 mmol/L，pH為7.4)定容至10 mL，室溫下黑暗處反應(yīng)12～16 h，使用前用上述PBS緩沖液適當(dāng)稀釋，使其在734 nm下吸光度為0.70±0.02.取10 μL樣品，加入PBS緩沖溶液至300 μL，加入上述稀釋液5 mL，混勻，30 ℃下反應(yīng)1 h.以去離子水為參比溶液，于734 nm下測定吸光度.ABTS自由基清除能力的計(jì)算公式為

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度.

2) 還原力.取140 μL樣品，加磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)至5 mL，與5 mL 1 g/L的鐵氰化鉀混合均勻后，50 ℃下反應(yīng)30 min，加入5 mL10 g/L的三氯乙酸，混合均勻，靜置10 min，取5 mL上清液，與5 mL去離子水和1 mL 0.1 g/L的三氯化鐵充分混合，以去離子水為參比溶液，在700 nm下測定[12-13].

1.3.4 發(fā)酵過程中pH變化

發(fā)酵過程中pH利用pH計(jì)進(jìn)行測定.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，對火龍果酵素發(fā)酵過程中總多酚含量、pH變化、ABTS自由基清除能力和還原力等各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析、主成分分析(Principal component analysis)和系統(tǒng)聚類分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)，P<0.05[14].

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中總多酚含量變化

以方程y=0.0 097x+0.019，R2=0.9 996為標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算火龍果酵素發(fā)酵過程中17 個時間點(diǎn)總多酚含量，方程中：y代表吸光度，x代表沒食子酸等價物(μg/mL).火龍果酵素發(fā)酵過程中總多酚含量的變化見圖1，從圖1可以看出：發(fā)酵過程中火龍果酵素發(fā)酵液中總多酚的含量整體上呈增加的趨勢，發(fā)酵487 d，從發(fā)酵初始的360.14 μg/mL增加至486.25 μg/mL，增加了35.02%.

圖1 火龍果酵素發(fā)酵過程中總多酚含量變化Fig.1 Changes of total polyphenols content in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.2 發(fā)酵過程中抗氧化能力變化

2.2.1 發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力變化

ABTS自由基清除能力實(shí)驗(yàn)中常用ABTS與過硫酸鉀反應(yīng)生成ABTS·+，ABTS·+可以溶于水溶液和有機(jī)溶液，可以用來測定水溶性可脂溶性抗氧化物的抗氧化能力[15].火龍果酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵液對ABTS自由基清除能力的變化見圖2，從圖2可以看出：隨著發(fā)酵時間的延長，火龍果酵素發(fā)酵液對ABTS自由基清除能力呈明顯增加的趨勢，經(jīng)487 d的發(fā)酵，清除能力從發(fā)酵初期的25.37%增加至47.43%，增加了86.95%.研究表明：大部分的天然抗氧化物是酚類物質(zhì)[14]，火龍果中富含原兒茶酸、香草酸、咖啡酸和丁香酸等多酚類物質(zhì)[16]，發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的ABTS自由基清除能力的增強(qiáng)可能與發(fā)酵液中多酚含量的變化有關(guān).

圖2 火龍果酵素發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力變化Fig.2 Changes of ABTS radical scavenging ability in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.2.2 發(fā)酵過程中還原力變化

還原力的測定主要是基于電子的轉(zhuǎn)移方法，抗氧化物通過轉(zhuǎn)移電子使Fe3+被還原，再向反應(yīng)液中加入FeCl3，生成的藍(lán)色物質(zhì)在700 nm處有最大吸收，通過測定吸光度來評價還原力的大小.吸光度高反應(yīng)抗氧化物的還原力強(qiáng)[15].火龍果酵素發(fā)酵過程中還原力的變化見圖3，從圖3可以看出：火龍果酵素發(fā)酵過程中還原力變化較慢，經(jīng)487 d發(fā)酵，吸光度從發(fā)酵初期的0.373增加到0.488，增加了30.83%，說明發(fā)酵過程中還原力增強(qiáng).

圖3 火龍果酵素發(fā)酵過程中還原力變化Fig.3 Changes of reducing power in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.3 發(fā)酵過程中pH變化

火龍果酵素發(fā)酵過程中pH的變化見圖4，由圖4可知：火龍果酵素發(fā)酵過程中，發(fā)酵初期pH值最高，為4.28，隨著發(fā)酵時間的延長，pH值逐漸降低，發(fā)酵至255～295 d，pH值最低，為3.94，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵至300 d后，pH值又緩慢升高，發(fā)酵至393～487 d，pH值穩(wěn)定在4.08左右.發(fā)酵過程中pH的變化可能與發(fā)酵過程中酵母菌、醋酸菌和乳酸菌等菌種代謝生成乳酸[17]、醋酸和琥珀酸酸性物質(zhì)有關(guān).

圖4 火龍果酵素發(fā)酵過程中pH變化Fig.4 Changes of pH in the fermentation of Pitaya Jiaosu

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

2.4.1 火龍果酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵液各指標(biāo)間相關(guān)性分析

采用SPSS 18.0軟件對火龍果酵素發(fā)酵過程中抗氧化能力(ABTS自由基清除能力和還原力)、總多酚和pH等評價指標(biāo)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表1.

表1各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

Table1Correlationcoefficientsof4indices

TPC1)ABTS2)RP3)pHTPC1．0000．7784)0．9294)-0．077ABTS1．0000．8654)-0．578RP1．000-0．146pH1．000

注：1) TPC為總多酚含量；2) ABTS為ABTS自由基清除能力；3) RP為還原力；4) 表示p<0.001.

從表1中可以看出：火龍果酵素發(fā)酵過程中，總多酚與ABTS自由基清除能力和還原力之間具有極顯著的正相關(guān)性(p<0.001)；ABTS自由基清除能力與還原力之間呈極顯著的正相關(guān)性(p<0.001)，而總多酚、ABTS自由基清除能力、還原力與pH之間存在負(fù)相關(guān)性.由各個指標(biāo)之間的相關(guān)性分析可知，部分指標(biāo)間存在著信息重疊，有必要對其進(jìn)行進(jìn)一步簡化以明確主要的綜合指標(biāo).

2.4.2 主成分分析

由各指標(biāo)相關(guān)性分析可知：火龍果酵素發(fā)酵過程中總多酚含量、ABTS自由基清除能力、還原力及pH 4 個抗氧化評價指標(biāo)間存在著相互重疊和相互干擾的狀態(tài)，因此需要選擇彼此不相關(guān)的新指標(biāo)來代替原來有相關(guān)性的指標(biāo)，消除多重共線性，以達(dá)到綜合評價的目的.將17 個不同時間點(diǎn)的火龍果酵素發(fā)酵液的總多酚含量、ABTS自由基清除能力、還原力和pH值等4 個參數(shù)依次輸入SPSS軟件進(jìn)行主成分分析，為了克服各個不同量綱變量的影響，先對各變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，再對各指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，主成分的特征值見表2，各成分特征值的碎石圖見圖5.

表2主成分的特征值、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率

Table2Theeigenvalue,contributionrateandthecumulativecontributionrateofprincipalcomponents

主成分特征值貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/%12．83370．82270．82221．06026．48997．31030．0862．14199．45240．0220．548100．000

圖5 碎石圖Fig.5 Scree plot

表2中給出了主成分的特征值，前兩個特征值均大于1，且前兩個主成分累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到原始信息的97.31%.從圖5可以看出：前兩個主成分的斜率陡峭，第三個主成分的斜率變緩，因此可以確定主成分的個數(shù)為2，使用這些成分在很大程度上減少了原始數(shù)據(jù)指標(biāo)的復(fù)雜性，僅丟失了2.69%的信息.第一主成分主要綜合了總多酚含量、ABTS自由基清除能力和還原力3 個評價指標(biāo)，且3 個評價指標(biāo)間具有正相關(guān)性；第二主成分主要綜合了pH指標(biāo)，且與其他3 個指標(biāo)間具有負(fù)相關(guān)性；與上述相關(guān)性分析結(jié)果相一致.利用2 個新變量來代替原來的4 個變量，新的變量分別用PC1，PC2表示，4 個指標(biāo)總多酚含量、ABTS自由基清除能力、還原力及pH經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的變量分別以ZTPC，ZABTS，ZRP和ZpH表示，它們之間的線性關(guān)系為

PC1=0.573×ZTPC+0.564×ZABTS+0.540×ZRP-0.248×ZpH

PC2=-0.203×ZTPC+0.201×ZABTS+0.343×ZRP+0.878×ZpH

2.4.3 綜合評價

以每個主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分總特征值之和的比例作為權(quán)重，經(jīng)線性加權(quán)求和得到綜合評價指標(biāo)(Comprehensive evaluation index，CEI)為

不同發(fā)酵時間點(diǎn)的火龍果酵素抗氧化評價指標(biāo)結(jié)果見表3和圖6.

表3抗氧化綜合評價指標(biāo)

Table3Comprehensiveevaluationindexofantioxidantcapacity

編號發(fā)酵時間/dPC1PC2綜合得分120-2．5950．784-1．675241-1．2480．721-0．712362-1．7050．764-1．0334102-1．2270．450-0．7705114-0．6260．538-0．3096137-1．6350．430-1．0737156-0．4110．306-0．21681740．0710．1960．1059214-0．960-1．054-0．98610235-0．670-1．295-0．84111255-0．484-1．608-0．790122750．093-1．360-0．303133592．5370．3921．953143931．3520．0581．000154261．8600．3791．457164562．8090．2372．109174872．8380．0622．082

圖6 抗氧化綜合評價指標(biāo)Fig.6 Comprehensive evaluation index of antioxidant capacity

從圖6可以看出：發(fā)酵至456 d以后，綜合評價指標(biāo)達(dá)到最高值且趨于穩(wěn)定，說明在此時間范圍內(nèi)火龍果酵素的抗氧化能力較優(yōu).

2.4.4 聚類分析

對火龍果酵素發(fā)酵過程中各指標(biāo)進(jìn)行因子分析，經(jīng)旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣見表4.首先利用主成分法提取因子，再利用Varimax最大方差法旋轉(zhuǎn)，經(jīng)3 次迭代收斂，從旋轉(zhuǎn)后的因子與原始變量的相關(guān)矩陣可以看出，第一主成分與3 個變量的相關(guān)較高，這3 個變量是ABTS自由基清除能力、還原力和總多酚的含量，第二主成分與pH的相關(guān)性更高.第一個因子主要概括了火龍果酵素發(fā)酵液中抗氧化成分及抗氧化能力情況，可以命名為抗氧化因子，第二因子是火龍果酵素發(fā)酵的環(huán)境，可以命名為環(huán)境因子.

表4 旋轉(zhuǎn)后因子載荷矩陣1)

注：1) 提取方法為主成分分析法；旋轉(zhuǎn)方法為方差最大正交旋轉(zhuǎn).

進(jìn)一步對不同發(fā)酵時間火龍果酵素的4 個評價指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，采用類間平均鏈鎖法(Between groups linkage)，依據(jù)綜合評價指標(biāo)間的歐氏距離的平方進(jìn)行聚類.聚類分析結(jié)果見圖7，圖7中編號對應(yīng)的發(fā)酵時間見表3.

從圖7中可以看出：系統(tǒng)樹狀圖直觀的顯示了聚類的整個過程，而且x軸方向給出了各類別之間的相對距離大小.在類間距離為10時，17 個不同發(fā)酵時間的火龍果酵素樣品可以分為3 類，聚為3 類，因子的分散點(diǎn)圖見圖8，從圖8可以看出：第一類聚集了1～8 個時間點(diǎn)，即20～174 d，聚集了發(fā)酵過程中總多酚、pH、ABTS自由基清除能力和還原力變化較明顯的階段，這個階段，火龍果酵素的抗氧化能力相對較低，發(fā)酵液的pH較高；第二類聚集了9～12 個時間點(diǎn)，即214～275 d，聚集了發(fā)酵過程中總多酚、pH和還原力變化較平緩的階段，這個階段，火龍果酵素的抗氧化能力、發(fā)酵液的pH相對較低；第三類聚集了13～17 個時間點(diǎn)，即359～487 d，聚集了發(fā)酵過程中火龍果酵素的抗氧化能力、發(fā)酵液的pH相對較高，此階段，火龍果酵素的抗氧化能力呈緩慢增加的趨勢，延長發(fā)酵時間有利于提升火龍果酵素的抗氧化能力.

圖7 聚類分析系統(tǒng)樹狀圖Fig.7 Hierarchical dendrogram

圖8 因子得分散點(diǎn)圖Fig.8 Scatter plot of factor score

3 結(jié) 論

對火龍果酵素發(fā)酵過程中發(fā)酵液的總多酚含量、ABTS自由基清除能力、還原力和pH值進(jìn)行跟蹤檢測，并采用相關(guān)分析、主成分分析和聚類分析，探討發(fā)酵時間對火龍果酵素抗氧化功能的影響，結(jié)果表明：隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中總多酚含量、ABTS自由基清除能力和還原力整體上呈增加的趨勢，火龍果酵素發(fā)酵液的pH呈緩慢降低的趨勢，從4.28降到4.08.董銀卯等[8]研究表明：火龍果酵素具有清除超氧陰離子自由基、DPPH自由基和羥基自由基的能力以及抗氧化活性；蔣增良等[2]對樹莓等酵素中總多酚含量與ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)、還原力測定等體外抗氧化評價指標(biāo)間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明：總多酚的含量與ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn)、還原力等顯著正相關(guān).火龍果酵素發(fā)酵過程中，不同時間點(diǎn)發(fā)酵液的總多酚含量與ABTS自由基清除能力、還原力的分析結(jié)果顯示：火龍果酵素中總多酚含量與ABTS自由基清除能力、還原力呈極顯著的相關(guān)性.通過主成分分析和聚類分析對火龍果酵素的抗氧化功能進(jìn)行評價，主成分分析結(jié)果表明：可以從總多酚含量、ABTS自由基清除能力、還原力和pH等4 個指標(biāo)中提取出2 個主成分，第一主成分/因子主要與總酚含量、ABTS清除率和還原力相關(guān)；第二主成分主要與pH相關(guān)；發(fā)酵至456 d以后，綜合評價指標(biāo)達(dá)到最高值且趨于穩(wěn)定，說明在此時間范圍內(nèi)火龍果酵素的品質(zhì)達(dá)優(yōu).聚類分析結(jié)果表明：在類間距離為10時，聚類分析可將發(fā)酵過程分為3 類，即因子顯著變化期、平緩期和緩慢增長期.

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