，， ，，，

(1.臨安區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站,浙江 杭州 311300；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院,浙江 杭州 310014)

國(guó)外的液泵型生物反應(yīng)器(Loop reactor)，因其產(chǎn)生的動(dòng)力，即液泵置于生物反應(yīng)器外部，輸送液體的泵通過管道與反應(yīng)器(或稱發(fā)酵罐)連接，使反應(yīng)器內(nèi)的液體(料液)與器外的管道形成一個(gè)環(huán)流，而空氣通過另一路管道通入反應(yīng)器中，使液體和空氣充分混合.這種液泵型生物反應(yīng)器屬外循環(huán)反應(yīng)器，其優(yōu)點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，傳熱、傳質(zhì)速率快[1-4]，但它最大的缺點(diǎn)是泵暴露在反應(yīng)器外面，無法進(jìn)行密封無菌操作，因此很容易染菌.近10 年來，浙江工業(yè)大學(xué)和鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備有限公司合作研制出了內(nèi)循環(huán)下噴式液泵型生物反應(yīng)器，即將耐熱泵置于反應(yīng)器內(nèi)，反應(yīng)器中還設(shè)計(jì)了射流閥和導(dǎo)流筒，以下噴式形式射向罐底，射流閥噴出的流體從罐底返回時(shí)液體從導(dǎo)流筒的中間與外邊分別翻起，加劇了液體的湍動(dòng)，增加了液體的溶解氧，有利于工業(yè)微生物的生長(zhǎng)和繁殖.筆者測(cè)試了20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器在不同通風(fēng)比(0.462，0.615，0.846)和不同循環(huán)液速(2.71，2.38，2.01，1.64 L/min)下容積氧傳遞系數(shù)KLa的變化規(guī)律，并與3 L攪拌式生物反應(yīng)器(即通用發(fā)酵罐)BioFlo110作對(duì)比試驗(yàn).筆者試驗(yàn)了β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌黑曲霉315在該反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵代謝情況，并與3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110作對(duì)比.

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

紫外/可見分光光度計(jì)751GD，上海市儀器分析一廠；下噴式液泵型20 L生物反應(yīng)器，鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備公司； 3 L攪拌式反應(yīng)器BioFlo 110，New Brunwick Scientific；HYG-A回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖瓶柜，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠.

1.2 方 法

1.2.1 亞硫酸鈉氧化法測(cè)定溶氧傳質(zhì)系數(shù)KLa

1) 亞硫酸鈉氧化法

溶氧傳質(zhì)系數(shù)KLa的測(cè)定方法采用亞硫酸鈉氧化法[5].

2) 溶氧傳質(zhì)性能的對(duì)比方法

在相同的操作壓力(0.1 MPa)和操作溫度(25 ℃)下，利用亞硫酸鈉氧化法分別測(cè)定兩個(gè)反應(yīng)器在不同的通風(fēng)比和不同轉(zhuǎn)速(液泵型反應(yīng)器對(duì)應(yīng)為循環(huán)液速)下的容積氧傳遞系數(shù)的大小，并初步選擇通風(fēng)比和轉(zhuǎn)速，使兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)大小相近.然后在轉(zhuǎn)速和其他條件不變的情況下，只改變通風(fēng)比，測(cè)定兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)；同時(shí)在通風(fēng)比和其他條件不變的情況下，只改變轉(zhuǎn)速，測(cè)定兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)； 根據(jù)所測(cè)容積氧傳遞系數(shù)，必能找出一組條件，使兩反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)相近，以此作為兩反應(yīng)器發(fā)酵性能對(duì)比的依據(jù).

1.2.2 菌種與培養(yǎng)基

1) 菌 種

黑曲霉315(A.Niger315)由實(shí)驗(yàn)室提供.

2) 培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10 g/L，小麥粉10 g/L，豆餅粉30 g/L.

3) 酶活的測(cè)定

β-葡聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考文獻(xiàn)[6].β-葡聚糖酶活力測(cè)定方法：以大麥β-葡聚糖為底物，采用DNS光電比色法測(cè)定.酶活單位定義：以β-葡聚糖為底物，采用DNS顯色，光電比色法，在pH=7.0，溫度40 ℃條件下，1 min使底物產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需的量，定義為一個(gè)單位(U).β-葡聚糖酶活力單位(U/mL)=r×Df/t，其中：r為與標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(μg/mL)；Df為待測(cè)酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間(5 min).

樣品測(cè)定：待測(cè)酶液用蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，取經(jīng)40 ℃預(yù)熱的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的β-葡萄糖溶液1.0 mL，混勻，再加入3 mL DNS試劑，然后沸水加熱5 min，待冷卻至室溫后測(cè)定OD值.

空白制作：取蒸餾水1 mL，先加入DNS試劑3.0 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的β-葡萄糖溶液1.0 mL，再加入水加熱5 min，待冷卻后，測(cè)定OD值.

2 結(jié)果與討論

2.1 兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)的對(duì)比試驗(yàn)

2.1.1 液泵型反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律的測(cè)試

表120L下噴式液泵型生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律測(cè)試實(shí)驗(yàn)

Table1TransfomationregulationofKLain20LJLRreactor

序列號(hào)通風(fēng)比vvm/(L·L-1·min-1)液泵轉(zhuǎn)速/(r·min-1)KLa/h-110．462∶180058．420．462∶1100076．130．462∶1120095．240．462∶11400111．450．615∶11200109．560．846∶11200120．970．615∶11400148．580．846∶11400173．3

當(dāng)通風(fēng)比一定時(shí)(0.462∶1)，液泵型反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著液泵轉(zhuǎn)速的增大而明顯增大，且有一定的線性關(guān)系.該反應(yīng)器的液泵轉(zhuǎn)速對(duì)應(yīng)著液噴速度的大小，當(dāng)通風(fēng)比一定時(shí)，增大液噴速度有利于減小氣泡直徑和氣體在水里的分散，從而容積氧傳遞系數(shù)明顯增大.通風(fēng)比一定時(shí)(0.462∶1)，KLa與液泵轉(zhuǎn)速的關(guān)系曲線線性度較高，這可能是由于在低通風(fēng)比(且通風(fēng)比一定)時(shí)，容積氧傳遞系數(shù)與液噴速度幾乎成正比關(guān)系，也就是容積氧傳遞系數(shù)KLa與氣、液噴速度的關(guān)聯(lián)式中，液噴速度的指數(shù)接近于1.

當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速一定時(shí)，該反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比的增大而增大，但無線性關(guān)系.這是因?yàn)樵龃笸L(fēng)比有利于增大持氣率和擴(kuò)大氣液界面面積，而增大持氣率和擴(kuò)大氣液界面面積均有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa.當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速為1 200 r/min時(shí)，容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比的變化不如液泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min時(shí)顯著，這說明在低液噴速度時(shí)，通風(fēng)比的變化對(duì)容積氧傳遞系數(shù)KLa的影響不顯著，此時(shí)液噴速度是瓶頸.

2.1.2 液泵型反應(yīng)器的液泵轉(zhuǎn)速與循環(huán)液速之間的關(guān)系

用自來水將反應(yīng)器注滿，即在反應(yīng)器內(nèi)裝入20 L水，調(diào)節(jié)并設(shè)置液泵轉(zhuǎn)速為800 r/min，待顯示屏的轉(zhuǎn)速讀數(shù)穩(wěn)定在800 r/min時(shí)，再往反應(yīng)器內(nèi)加水，直至加滿，準(zhǔn)備好秒表，在打開排料閥門的同時(shí)按下秒表開始記時(shí)，當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)水排完的瞬間按一下秒表，結(jié)束記時(shí).照此，改變轉(zhuǎn)速為1 000，1 200，1 400，1600 r/min，進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2.

表220L下噴式液泵型生物反應(yīng)器液泵轉(zhuǎn)速與循環(huán)液速關(guān)系

Table2Relationshipbetweenpump’sagitationandliguidcircularratein20LJLPreactor

序列號(hào)液泵轉(zhuǎn)速/(r·min-1)循環(huán)周期/min循環(huán)液速/(L·min-1)平均循環(huán)液速/(L·min-1)6．503．0818006．433．113．096．483．087．402．70210007．352．722．717．362．718．412．38312008．482．363．388．342．399．962．014140010．051．992．019．812．0412．181．645160012．241．631．6412．201．65

表2反映了液泵轉(zhuǎn)速與循環(huán)液速之間的關(guān)系，每一個(gè)液泵轉(zhuǎn)速必對(duì)應(yīng)著一個(gè)循環(huán)液速，即兩者有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，一般來說液泵轉(zhuǎn)速大，相應(yīng)的循環(huán)液速也較大.

2.1.3 攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律的測(cè)試

表3攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律測(cè)試實(shí)驗(yàn)表

Table3TransfomationregulationofKLainagitationreactor

序列號(hào)通風(fēng)比vvm/(L·L-1·min-1)攪拌轉(zhuǎn)速/(r·min-1)KLa/h-111∶120042．1021∶130051．3031∶140094．4341∶1500157．0551∶1600282．7361．25∶1500162．1071．5∶1500173．20

由表3可知：攪拌式反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比、攪拌轉(zhuǎn)速的變化而變化，且隨它們的增大而增大.當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速一定時(shí)，攪拌式反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比的增大而增大，但這一變化不是很顯著.這有可能是在較高的攪拌轉(zhuǎn)速下，影響容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素不再是通風(fēng)量，也就是通風(fēng)量對(duì)容積氧傳遞系數(shù)KLa的貢獻(xiàn)不大.當(dāng)通風(fēng)比一定時(shí)，增大攪拌轉(zhuǎn)速有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa.但也不難發(fā)現(xiàn)低轉(zhuǎn)速區(qū)，增大攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)容積氧傳遞系數(shù)KLa的提高不如高轉(zhuǎn)速區(qū)顯著.這說明在低轉(zhuǎn)速區(qū)，影響容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素不是攪拌轉(zhuǎn)速，通風(fēng)量的影響可能起重要作用.

2.1.4 液泵型生物反應(yīng)器與攪拌式生物反應(yīng)器的對(duì)比

由液泵型反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律可知：在溫度和壓力等操作條件一定時(shí)，影響液泵型反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素是液泵轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比.當(dāng)通風(fēng)比一定時(shí)容積氧傳遞系數(shù)隨液泵轉(zhuǎn)速的變化幾乎成線性關(guān)系；而當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速一定時(shí)，容積氧傳遞系數(shù)隨通風(fēng)比的增大而增大，但這一變化的程度取決于液泵轉(zhuǎn)速的大小，在高液泵轉(zhuǎn)速下，這一變化較顯著.

由攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律可知：在溫度和壓力等操作條件一定時(shí)，影響攪拌式生物反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)KLa的主要因素是攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)比.當(dāng)通風(fēng)比一定時(shí)，增大攪拌轉(zhuǎn)速有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa，這一變化在高攪拌轉(zhuǎn)速區(qū)比在低攪拌轉(zhuǎn)速區(qū)顯著.當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速(較高)一定時(shí)，增大通風(fēng)比有利于提高容積氧傳遞系數(shù)KLa，但這一變化并不顯著.

攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min、通風(fēng)比為1.5∶1的3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110與液泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min、通風(fēng)比為0.846∶1的20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器具有幾乎相同的容積氧傳遞系數(shù)KLa(173.2 h-1).在試驗(yàn)的系列范圍內(nèi)，改變20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器的通風(fēng)比和液泵轉(zhuǎn)速為適當(dāng)值時(shí)，能找到一組操作變量(通風(fēng)比和液泵轉(zhuǎn)速)使其容積氧傳遞系數(shù)KLa與3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110的容積氧傳遞系數(shù)KLa相等，這為后述實(shí)罐發(fā)酵對(duì)比奠定基礎(chǔ).

2.2 兩反應(yīng)器用于黑曲霉315生產(chǎn)β-葡聚糖酶的發(fā)酵性能對(duì)比

2.2.1 發(fā)酵過程基本操作

根據(jù)1.2.2節(jié)2)中列出的黑曲霉315生產(chǎn)β-葡聚糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方要求，分別配制13，1.75 L培養(yǎng)基基質(zhì)，加自來水分別稀釋培養(yǎng)基至9，1.75 L(對(duì)于20 L反應(yīng)器事先進(jìn)行一次空消，計(jì)算出冷卻水體積為4 L)，然后分別進(jìn)行一次實(shí)罐滅菌操作，待培養(yǎng)基冷卻后，按5%的接種量分別向兩反應(yīng)器接入經(jīng)擴(kuò)培后的黑曲霉315種子液(注意無菌操作的規(guī)范性和嚴(yán)謹(jǐn)性).以兩反應(yīng)器容積氧傳遞系數(shù)變化規(guī)律的對(duì)比試驗(yàn)得出的使兩反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)相近的一組通風(fēng)比、轉(zhuǎn)速條件作為本次發(fā)酵的通風(fēng)比、轉(zhuǎn)速的條件(液泵型生物反應(yīng)器的液泵轉(zhuǎn)速為1 400 r/min、通風(fēng)比為0.846∶1；攪拌式生物反應(yīng)器的攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min、通風(fēng)比為1.5∶1，而且一直保持到發(fā)酵結(jié)束為止.調(diào)節(jié)兩反應(yīng)器的溫度控制系統(tǒng)，控制發(fā)酵溫度在30 ℃，調(diào)節(jié)20 L反應(yīng)器的進(jìn)出口閥門，控制反應(yīng)器內(nèi)的表壓為0.05 MPa，待兩反應(yīng)器基本參數(shù)穩(wěn)定后，開始取樣，開始兩次隔8 h取一次樣，估計(jì)16 h以后酶活開始上升，所以以后每隔2 h取一個(gè)樣，并盡快對(duì)所取的樣品進(jìn)行β-葡聚糖酶酶活的測(cè)定.

2.2.2 兩反應(yīng)器中β-葡聚糖酶產(chǎn)生菌株發(fā)酵結(jié)果

兩發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶代謝曲線見圖1，2.由圖1，2可知：液泵型生物反應(yīng)器發(fā)酵黑曲霉所得的β-葡聚糖酶的酶活優(yōu)于攪拌式反應(yīng)器，而且高峰期提前6 h，并且上升速率(從開始上升到到達(dá)高峰的速度)也較快.分析其原因有以下幾點(diǎn)：1) 黑曲霉為嚴(yán)格的好養(yǎng)菌，在其生長(zhǎng)高峰期對(duì)氧的需求量特別大，液泵型生物反應(yīng)器利用高速液體射流的動(dòng)能是其在反應(yīng)器中均勻分散、懸浮，繼而在反應(yīng)器內(nèi)形成整體的環(huán)流，使各相密切接觸，很好地保證了此時(shí)黑曲霉對(duì)氧的需求；2) 黑曲霉為絲狀真菌，攪拌式反應(yīng)器的攪拌裝置對(duì)黑曲霉有較大的剪切力損傷，影響了黑曲霉的生長(zhǎng)，導(dǎo)致了酶活的降低，而液泵型生物反應(yīng)器對(duì)黑曲霉的剪切力損傷較小，黑曲霉可以正常生長(zhǎng)，所以所得的β-葡聚糖酶的酶活也相對(duì)較高.

圖1 20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器中酶活變化曲線Fig.1 Time curve of enzymatic activity in 20 L reversed jet loop reactor

圖2 3 L攪拌式生物反應(yīng)器中中酶活變化曲線Fig.2 Time curve of enzymatic activity in 3L universal fermenter

3 結(jié) 論

20 L下噴式液泵型生物反應(yīng)器的容積氧傳遞系數(shù)KLa隨通風(fēng)比、液泵轉(zhuǎn)速的提高而增大，且當(dāng)通風(fēng)比一定時(shí)，KLa與液泵轉(zhuǎn)速的關(guān)系曲線線性度較高，當(dāng)液泵轉(zhuǎn)速一定時(shí)，低液噴速度時(shí)通風(fēng)比的變化對(duì)容積氧傳遞系數(shù)KLa的影響不如高液噴速度時(shí)顯著.3 L攪拌式生物反應(yīng)器BioFlo110容積氧傳遞系數(shù)KLa隨著通風(fēng)比、攪拌轉(zhuǎn)速的增大而增大，且低攪拌轉(zhuǎn)速區(qū)時(shí)，增大攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)容積氧傳遞系數(shù)KLa的提高不如高轉(zhuǎn)速區(qū)時(shí)顯著.通過實(shí)驗(yàn)，找到使兩反應(yīng)器的KLa相等的一組操作條件，并為發(fā)

酵條件的控制奠定基礎(chǔ).通過黑曲霉315在兩反應(yīng)器內(nèi)的發(fā)酵性能對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在使兩反應(yīng)器KLa相等的那組操作條件下，兩反應(yīng)器的氧傳速率存在差別，且兩反應(yīng)器的內(nèi)部構(gòu)造存在較大差別，這導(dǎo)致細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境的顯著不同，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)液泵型反應(yīng)器適合黑曲霉等微生物的發(fā)酵代謝，得到的發(fā)酵結(jié)果相對(duì)較好，且發(fā)酵時(shí)間縮短了6 h，大幅度節(jié)省了能耗.

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