陶叢敏，冶 娟，馬文宇，羅文娟

人的皮膚老化主要表現(xiàn)為自然衰老和光老化兩種形式[1]。由內(nèi)源性因素引起的皮膚老化，多表現(xiàn)為正常的皮紋加深，皮膚干燥變薄、失去彈性、松弛和粗糙[2]。光老化主要是由于皮膚在急性或長期反復(fù)由紫外線（UV）照射引起，主要變化包括皺紋深亂粗深、色素沉著、癌前病變等[3,4]。本研究主要通過觀察青海黑果枸杞原花青素對D-半乳糖皮下注射聯(lián)合UV照射引起的小鼠光老化模型皮膚組織中氧化應(yīng)激水平和凋亡蛋白的變化，以及血清中炎性因子的改變，了解黑果枸杞原花青素對光老化皮膚的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康SPF級昆明種雌性小鼠50只，45 d齡，體質(zhì)量18～22 g，購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[0001209]。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和設(shè)備 青海黑果枸杞原花青素粉末（西安萬方生物）；維生素E粉末（北京索萊寶）；D-半乳糖（北京索萊寶）；UV[長波紫外線（UVA）+中波紫外線（UVB）]光療儀（南京卡知電子科技有限公司）；UVB 和UVA 型UV 輻照度監(jiān)視器（臺灣路昌）；活性氧（ROS）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Bax、Bcl-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物公司）；白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α ELISA試劑盒 （武漢基因美生物科技有限公司）；X-Mark型BIO-RAD酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司），TGrinder電動組織研磨器（北京天根生化科技有限公司），SIGMA 3K15離心機(jī)（Sigma公司），恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將50只小鼠隨機(jī)分為5組，正常組、模型組、維生素E組、黑果枸杞原花青素低劑量組50 mg/(kg·d)、黑果枸杞原花青素高劑量組（100 mg/(kg·d)，每組 10只,并做好標(biāo)記。

1.2.2 動物飼養(yǎng) 小鼠每10只放入一籠飼養(yǎng)，在相同的自然環(huán)境下（晝夜交替12 h）飼養(yǎng)1 周，常規(guī)飼食和飲水，無不良因素影響，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 脫毛 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用6%的硫化鈉脫毛劑除去表面毛發(fā)，暴露約5×5 cm大小的皮膚，視毛發(fā)生長情況進(jìn)行脫毛。

1.2.4 照光 第2周開始，除正常組外，每組頸背部皮下注射5%D-半乳糖10 ml/(kg·d)，同時(shí)進(jìn)行UV照射。將小鼠放入自制照射盒中，并置于距離光源( UVA + UVB) 40 cm 處的水平面上，隔日照射1 次，每次40 min。每次照射前燈管預(yù)熱15 min，且照射前均測光強(qiáng)度，初次正式照射前，先測定最小紅斑量及光照射強(qiáng)度，累計(jì)照射40 d（UVA 照射劑量累計(jì)為98.4 J，UVB 輻照劑量累計(jì)為 78.4 J）。

1.2.5 給藥與處理 造模第11天開始，黑果枸杞原花青素低劑量組和黑果枸杞原花青素高劑量組按劑量[50 mg/(kg·d)和100 mg/(kg·d)]灌胃黑果枸杞原花青素，正常組和模型組則每日灌胃等體積的生理鹽水，維生素E組每只給予維生素E滴劑0.5 ml，連續(xù)用藥30 d。

1.2.6 取材 實(shí)驗(yàn)第42天，所有小鼠行眼球取血，置于1.5 ml EP管中室溫靜置1 h，2 500 r/min，離心15 min后取上清，于-80℃保存，進(jìn)行IL-1、IL-6、TNF-α檢測。取照光處皮膚（刮除皮下脂肪），在冰凍的生理鹽水中漂洗，冷凍于-80℃冰箱制備成10%皮膚組織勻漿，放入離心機(jī)以3 500 r /min離心15 min。取組織上清進(jìn)行保存于-80℃冰箱，進(jìn)行ROS、CAT 活力及 Bax 、Bcl-2 含量檢測[7]。

1.2.7 指標(biāo)檢測 酶生化法測定皮膚組織ROS及CAT 活力，按上述方法處理皮膚組織后嚴(yán)格按照說明書檢測ROS及CAT 活力。采用ELISA檢測各組小鼠皮膚組織中Bax 、Bcl-2及血清中IL-1、IL-6、TNF-α的含量。按試劑盒說明書步驟操作，以450 nm 測A值，以A值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Curve Expert 1.4軟件對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行擬合。根據(jù)樣品A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算樣本的濃度 。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 Excel 2003錄入實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用 SPSS 20.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜ 0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察小鼠皮膚變化

正常組小鼠皮膚光滑、細(xì)嫩、無皺紋，而隨著UV的照射，模型組小鼠皮膚粗糙增厚，并有皺紋及脫屑、瘀點(diǎn)和瘀斑，經(jīng)黑果枸杞原花青素治療后的小鼠皮膚出現(xiàn)一定改善，其皮膚脫屑較模型組減少，皮膚接近正常，而經(jīng)過維生素E治療的小鼠，雖然皮膚有所改善，但沒有使用黑果枸杞原花青素明顯（圖1）。

2.2 肉眼觀察皮下血管變化

正常組小鼠皮下血管正常，淡紅色，無充血及瘀點(diǎn)；模型組小鼠皮下血管擴(kuò)張，呈暗紅色，出現(xiàn)結(jié)節(jié)和瘀點(diǎn)；原花青素組的小鼠皮下血管有輕度充血，少量結(jié)節(jié)，但隨著劑量的增大，皮下血管的變化接近正常；維生素E組小鼠皮下血管充血較模型組減輕，但沒有原花青素組改變的明顯（圖2）。

2.3 小鼠皮膚組織抗氧化指標(biāo)活力和凋亡蛋白含量測定及小鼠血清炎性因子含量測定

圖1 5組小鼠皮膚外觀

圖2 5組小鼠皮膚血管鏡下所見

2.3.1 小鼠皮膚組織抗氧化指標(biāo)活力測定 與正常組相比，模型組ROS活力顯著升高，CAT 活力顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素低、高劑量組ROS下降，CAT 活力升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與維生素E組比較，原花青素低、高劑量組ROS活力下降及CAT活力升高更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表 1）。

表1 各組小鼠皮膚組織ROS、CAT活力比較 （ ±s）

表1 各組小鼠皮膚組織ROS、CAT活力比較 （ ±s）

注：與正常對照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，$P＜0.05；與維生素E組比較，&P＜0.05

組 別 n ROS活力(IU/ml)CAT活力(U/mgprot)正常組 10 93.18±9.57 25.31±4.61模型組 10 139.95±9.79# 11.51±2.70#維生素E組 10 126.94±7.02#$ 16.35±2.16#$原花青素低劑量組 10 108.34±10.80#$ 19.84±1.75#$&原花青素高劑量組 10 96.21±5.83$ & 24.31±2.67$&F值 52.15 37.68 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3.2 皮膚組織凋亡因子含量表達(dá)情況 空白對照組Bax表達(dá)水平較低，Bcl-2表達(dá)升高；與正常組比較，模型組Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；與模型組比較，原花青素低、高劑量組Bax表達(dá)水平較低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與維生素E組比較，原花青素低、高劑量組的Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)更加明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）（表2）。

表2 各組小鼠皮膚組織Bax、Bcl-2含量比較 （ ±s）

表2 各組小鼠皮膚組織Bax、Bcl-2含量比較 （ ±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與維生素E組比較，&P＜0.05

組 別 n Bax（ng/ml） Bcl-2 （pg/ ml）正常組 10 10.80±1.43 2521.81±696.07模型組 10 20.12±1.68* 959.96±123.18*維生素E組 10 17.30±1.58 *# 1228.36±85.65*#原花青素低劑量組 10 15.45±1.78*#& 1442.98±98.40*#&原花青素高劑量組 10 11.29±1.28#& 1959.84±309.17#&F值 64.77 40.08 P值 ＜0.001 ＜0.001

2.3.3 小鼠血清炎性因子含量檢測結(jié)果 與正常組比較，模型組IL-1、IL-6、TNF-α的含量顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，原花青素低、高劑量組IL-1、IL-6、TNF-α含量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與維生素E組比較，原花青素低、高劑量組IL-1、IL-6、TNF-α含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

3 討論

黑果枸杞為茄科枸杞屬，在我國主要分布于寧夏、青海、新疆、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅和西藏等地，而青海地區(qū)特殊的地理及氣候條件使黑果枸杞種植較多，并且其原花青素的含量要高于其他地區(qū)[5]。樓舒婷等[6]對黑果枸杞活性成分和揮發(fā)性組分進(jìn)行了研究，詳細(xì)闡述了黑果枸杞在飲食、保健方面的應(yīng)用價(jià)值，而對于其抗氧化成分的研究主要集中在黃酮、多糖、多芬類，對原花青素抗氧化、延緩衰老方面的研究尚少[7]。本文通過對黑果枸杞原花青素對光老化皮膚的抗氧化作用，進(jìn)一步探討了黑果枸杞在延緩衰老方面的機(jī)制。

表3 各組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量比較（ ±s）（pg/ml）

表3 各組小鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α含量比較（ ±s）（pg/ml）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與維生素E組比較，△P＜0.05

組 別 n IL-1 IL-6 TNF-α正常組 10 27.49±9.15 10.09±4.67 230.21±53.76模型組 10 131.96±29.84* 47.59±10.18* 552.09±105.98*維生素E組 10 97.34±6.21*# 32.53±3.11*# 387.16±58.37*#原花青素低劑量組 10 60.02±15.83*#△ 22.05±4.79*#△ 314.30±22.60*#△原花青素高劑量組 10 34.61±4.66 #△ 11.94±3.05#△ 238.11±46.49#△F值 75.36 72.42 43.44 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

由于人體的皮膚老化受多種因素的影響，外源性因素是UV長期照射皮膚造成光老化，日光中UV主要由UVB（波長290～320 nm）和UVA（波長320～400 nm）組成，其中UVB是造成皮膚損傷的主要原因[8]。然而，日光中UVA與UVB是不可能分隔的，許多研究還表明UVA有加強(qiáng)UVB的作用，誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生凋亡與皮膚衰老密切相關(guān)。D-半乳糖可引起氧化應(yīng)激，使細(xì)胞清除自由基的能力下降，細(xì)胞發(fā)生一系列退行性變化，呈現(xiàn)衰老狀態(tài)[9]。

以往的研究大多集中在細(xì)胞水平，本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合光源（UVB＋UVA）模擬日光，聯(lián)合D-半乳糖皮下注射建立光老化動物模型，更符合人體皮膚老化的生理過程。UV照射后，皮膚組織中會產(chǎn)生大量ROS，正常情況下皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和CAT等，均可對活性氧簇的釋放起到一定的抵御作用。大量UV照射后，體內(nèi)各種抗氧化酶的活性降低，從而致使細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷以及核內(nèi)DNA鏈斷裂等，促使一些炎性因子的釋放[10]。再次，UV照射后，線粒體產(chǎn)生ROS水平升高，也可通過自噬途徑增加ROS水平， 進(jìn)一步致細(xì)胞凋亡甚至變性壞死。Bax、Bcl-2是細(xì)胞凋亡的主要凋亡蛋白，UV照射后，線粒體通透性改變，細(xì)胞色素C釋放，凋亡蛋白增加[11-13]；另一方面，二者比例也對細(xì)胞凋亡起著調(diào)節(jié)作用。UV照射后，NF-K B信號通路被激活，真皮（基質(zhì)金屬蛋白酶）MMPs表達(dá)增加，炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平增高，最終增強(qiáng)光老化作用[14-17]。

本實(shí)驗(yàn)中，與正常組的結(jié)果比較顯示，經(jīng)紫外線照射后，小鼠皮膚表面干燥、粗糙、脫屑，出現(xiàn)皺紋，皮下血管擴(kuò)張、充血，并伴有結(jié)節(jié)和瘀點(diǎn)。模型組皮膚組織中ROS活力顯著升高，CAT 活力顯著下降；Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)，Bcl-2水平降低；血清炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平增高；說明光老化模型造模成功；經(jīng)黑果枸杞原花青素灌胃后，與維生素E組相比，原花青素低、高劑量組小鼠皮膚組織中ROS活力顯著下降，CAT 活力顯著升高；Bax的表達(dá)水平顯著下調(diào)，Bcl-2水平上調(diào)；血清IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平降低，說明黑果枸杞原花青素對其表達(dá)有抑制作用，且隨著給藥濃度的增加，作用逐漸加強(qiáng)，表明其抗光老化可能存在濃度依賴。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黑果枸杞原花青素對皮膚光老化有一定的改善作用，其機(jī)制可能與黑果枸杞原花青素抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生，降低線粒體通透性，抑制細(xì)胞色素C釋放，抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)。通過此實(shí)驗(yàn)，為黑果枸杞抗衰老、美容養(yǎng)顏功效產(chǎn)品的研制提供理論依據(jù)。

【參 考 文 獻(xiàn)】

[1]Fisher GJ, ang S, arani J, et al. Mechanisms of photoaging and chronological skin aging [J]. Arch Dermatol, 2002, 138 (11):1462- 1470.

[2]Imayama S, Ueda S, lsoda M. Histologic changes in the skin of hairless mice following peeling with saiicvlic acid [J]. Arch Dermatol,2000, 136(11):1390-1395.

[3]Agbai ON, Buster K, Sanchez M, et al. Skin cancer and photo-protection in people of color: a review and recommendation for physicians and the public [J]. J Am Acad Dermatol, 2014, 70(4):748-762.

[4]吳淑蓮, 喻碧鸞, 李暉, 等. IPL作用下鼠皮形態(tài)改變的顯微觀察與初步分析 [J]. 激光生物學(xué)報(bào), 2006, 15 (3):249-252.

[5]汪洋, 丁龍, 王四清. 不同產(chǎn)地黑果枸杞中原花青素和花青素含量研究 [J]. 食品工業(yè)科技, 2016, 37(13):122-124.

[6]樓舒婷. 黑果枸杞的活性成分和揮發(fā)性組分研究 [D]. 浙江大學(xué), 2015.

[7]陳晨, 文懷秀, 趙曉輝, 等. 黑果枸杞色素中原花青素含量測定 [J].光譜實(shí)驗(yàn)室, 2011, 28(4):1767-1769.

[8]Song KC, Chang TS, Lee H, et al. Processed panax ginseng, sun ginseng increases type I collagen by regulating MMP-1 and TIMP-1 expression in human dermal fibroblasts [J]. J Ginseng Res, 2012, 36(1):61-71.

[9]Terra VA, Souza-neto FP, Pereira RC, et al. Time-dependent reactive species formation and oxidative stress damage in the skin after UVB irradiation [J]. J Photochem Photobiol B, 2012,109 (2): 34-41.

[10]呂燕紅. 枸杞葉總黃酮對UVB照射致無毛小鼠皮膚光損傷的防護(hù)作用研究 [D]. 蘭州大學(xué), 2016.

[11]Czarny P, Pawlowska E, Bialkowskawarzecha J, et al. Autophagy in DNA damage response [J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(2):2641.

[12]Yao R, Tanaka M, Misawa E, et al. Daily Ingestion of aloe vera gel powder containing aloe sterols prevents skin photoaging in OVX hairless mice [J]. J Food Sci , 2016, 81(11):H2849-H2857.

[13]Pandel R, Poljak B, Godic A. Skin photoaging and the roleof antioxidants in its prevention [J]. ISRN Dermatol, 2013:930164.

[14]王瑩. Caspase-3、Bax、Bcl-2和Beclin-1在慢性紫外線損傷小鼠模型表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)及意義 [D]. 天津醫(yī)科大學(xué), 2012.

[15]Kyung-AH, Yi BR, Kyung-Chul C. Molecular mechanisms and in vivo mouse models of skin aging associated with dermal matrix alterations [J]. Lab Anim Res, 2011, 27(1):1-8.

[16]Youn HJ, Kim KB, Han HS, et al. 23-Hydroxytormentic acid protects human dermal fibroblasts by attenuating UVA-induced oxidative stress[J]. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 2017, 33(2):92-100.

[17]Park JE, Pyun HB, Woo SW, et al. The protective effect of Kaempferia parviflora extract on UVB-induced skin photoaging in hairless mice [J]. Photodermatol Photoimmunol Photomed, 2014,30(5):237-245.