朱玲玲，陳寶軍

臺(tái)州恩澤醫(yī)療中心（集團(tuán)）臺(tái)州醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 317000

高尿酸血癥是由尿酸的產(chǎn)生和排泄功能障礙而引起其水平升高為特征的一種疾病。尿酸是嘌呤化合物的代謝終產(chǎn)物，在黃嘌呤氧化酶作用下，次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，黃嘌呤氧化成尿酸[1]。痛風(fēng)是一種與體內(nèi)高尿酸水平相關(guān)的代謝紊亂疾病，可以引起炎癥、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和尿酸性腎結(jié)石。目前針對(duì)痛風(fēng)的治療方法主要是治療炎癥和控制高尿酸血癥，黃嘌呤氧化酶被認(rèn)為是高尿酸血癥最重要的治療靶點(diǎn)[2]。別嘌呤醇是一種肝臟黃嘌呤氧化酶抑制劑，主要用于治療高尿酸血癥和痛風(fēng)。然而，它的臨床用途經(jīng)常受到副作用的限制，例如發(fā)熱、皮膚皮疹、過(guò)敏反應(yīng)、肝炎、史蒂文斯-約翰遜綜合征等，甚至發(fā)生致死性肝壞死和腎病。因此，急需開(kāi)發(fā)一種對(duì)高尿酸血癥和痛風(fēng)治療有效的替代療法[3]。

七葉蓮[Schefflera venulosa(Wight et Arn.)Harms]為五加科鵝掌柴屬植物，又名漢桃葉、七加皮、七葉爛、手樹(shù)等，廣泛分布于我國(guó)華南地區(qū)，主產(chǎn)于我國(guó)廣東、廣西、福建、臺(tái)灣、云南和貴州等地。性溫，味微苦，主要含有萜烯類、三萜皂苷類和有機(jī)酸類等化學(xué)成分，具有祛風(fēng)除濕、催眠和活血止痛等功效，對(duì)三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、神經(jīng)性頭痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛以及跌打腫痛等均有一定的緩解作用[4～7]。近年來(lái)，對(duì)于七葉蓮的化學(xué)成分和藥理活性的研究逐漸增多，具有較好的開(kāi)發(fā)前景，引起了許多學(xué)者的關(guān)注[8～9]。本研究的目的是通過(guò)體外相關(guān)酶系統(tǒng)和體內(nèi)高尿酸血癥小鼠模型來(lái)確定七葉蓮總皂苷對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性和抗高尿酸血癥作用，并探討其對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 七葉蓮藥材采自云南省文山壯族苗族自治州文山縣，七葉蓮總皂苷由本實(shí)驗(yàn)室自制；氧嗪酸鉀，乙胺丁醇，別嘌呤醇(湖北信康醫(yī)藥化工有限公司)；黃嘌呤(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)；血清尿酸測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Lowry蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Solarbio公司)；Anti-URAT1(美國(guó) Abcam 公司)；TRE-Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)。其余試劑均為分析純；水為純凈水。

雄性ICR小鼠60只，4周齡，體質(zhì)量(22±2)g，購(gòu)自浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(浙)2014-0012。在溫度為(23±2)℃、濕度為(50±10)%、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 體外黃嘌呤氧化酶活性測(cè)定 通過(guò)檢測(cè)在反應(yīng)系統(tǒng)中尿酸的生成量來(lái)衡量七葉蓮總皂苷對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制活性。該反應(yīng)系統(tǒng)包括0.6mL的100mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，0.1 mL樣品，0.1 mL黃嘌呤氧化酶(0.2 U/mL)和0.2 mL的1 mmol/L黃嘌呤(溶于0.1 mol/L NaOH溶液中)。通過(guò)加入含有或不含有抑制劑的酶來(lái)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)15 min后，加入0.2 mL的1 mol/L HCl來(lái)終止反應(yīng)，比較反應(yīng)前后，該體系在290 nm處的吸光度改變。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組和七葉蓮總皂苷低(200 μg/mL)、中(400 μg/mL)、高(800 μg/mL)劑量組，采用別嘌呤醇(30 μg/mL)作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

1.3 模型的建立、分組及干預(yù) 60只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠按10 mg/kg的劑量給予別嘌呤醇溶液；七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠分別給予劑量為50、100、200 mg/kg的七葉蓮總皂苷提取液；正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠給予同體積0.3%羧甲基纖維素鈉水溶液。采用氧嗪酸鉀和乙胺丁醇造成小鼠高尿酸血癥病理模型。正常對(duì)照組小鼠使用PBS來(lái)代替，其它各組小鼠從第4天開(kāi)始給予250 mg/(kg·d)乙胺丁醇(灌胃給藥)和 100 mg/(kg·d)氧嗪酸鉀(腹腔注射)，連續(xù)造模給藥4天。在最后一次預(yù)處理1 h后，通過(guò)小鼠眼眥靜脈收集大約0.5 mL血液樣本，在4℃下放置1 h后，以10 000 g離心15 min獲得血清。同時(shí)取小鼠肝臟和腎臟一并冷凍保存待測(cè)。

1.4 小鼠體內(nèi)尿酸濃度和黃嘌呤氧化酶活性測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑來(lái)測(cè)定血清中的尿酸濃度。在小鼠肝臟中黃嘌呤氧化酶的活性是通過(guò)分光光度法測(cè)定黃嘌呤生成尿酸的量來(lái)完成。0.5 g小鼠肝臟在1 mL 50 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4)中勻漿，在4℃條件下，以3 000 g離心10 min。除去脂質(zhì)層之后，上清液在4℃條件下以10 000 rpm離心60 min。再次分離上清液用于測(cè)定黃嘌呤氧化酶活性與總蛋白濃度。50 mmol/L pH 7.4磷酸鈉緩沖液包含10 μL肝組織勻漿和0.54 mL 1 mmol/L的氧嗪酸鉀溶液，并在35℃下預(yù)孵15 min，加入0.12 mL 250 mmol/L黃嘌呤溶液。分別在0和30 min時(shí)，加入0.1 mL 0.6 mol/L HCl終止反應(yīng)。并以3 000 g離心5 min，測(cè)定上清液在295 nm處的吸光度值?？偟鞍诐舛扔肔owry法來(lái)測(cè)定。黃嘌呤氧化酶的活性用每毫克蛋白質(zhì)每分鐘形成尿酸的微摩爾數(shù)來(lái)表示。

1.5 小鼠腎臟URAT1的蛋白表達(dá)水平 采用Western blot法測(cè)定小鼠腎臟URAT1的蛋白表達(dá)水平。取小鼠腎皮層組織以含PMSF的裂解液RIPA提取蛋白，再以Lowry蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度。上述蛋白經(jīng)10%的SDS-PAGE電泳分離后，在200 mA條件下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(2 h)，以5%的脫脂奶粉封閉 1 h后，一抗 URAT1(1∶1 000)和內(nèi)參β-actin(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜。再以HRP標(biāo)記二抗(1∶5 000)孵育1 h，顯色后采用WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)軟件Gelpro32分析膠片中的Western blot蛋白條帶中的灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料以(x±s)表示，顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 體外黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用比較 見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組及七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組能夠顯著地抑制黃嘌呤氧化酶的活性(P＜0.05)。隨著七葉蓮總皂苷濃度的上升，其對(duì)黃嘌呤氧化酶活性抑制作用也顯著上升(P＜0.05)。本實(shí)驗(yàn)為在體外建立的黃嘌呤氧化酶活性測(cè)定體系，獨(dú)立于后面的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，未造模，不設(shè)模型對(duì)照組。

表1 體外黃嘌呤氧化酶活性的抑制作用比較(x±s)

2.2 各組小鼠體內(nèi)血清尿酸水平比較 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清尿酸水平顯著升高(P＜0.05)。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的血清尿酸水平顯著降低(P＜0.05)，具有一定的劑量依賴性。

2.3 各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性比較 見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶的活性沒(méi)有明顯的差異。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組、七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的肝臟黃嘌呤氧化酶活性顯著降低(P＜0.05)，具有一定的劑量依賴性。

2.4 各組小鼠腎臟URAT1的蛋白表達(dá)水平比較 見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠腎臟URAT1蛋白表達(dá)水平顯著上升(P＜0.05)。與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的腎臟URAT1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)。

表2 各組小鼠體內(nèi)血清尿酸水平比較(x±s)

表3 各組小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶活性比較(x±s)

表4 各組小鼠腎臟URAT1的蛋白表達(dá)水平比較(x±s)

3 討論

高尿酸血癥是以血液中具有較高水平的尿酸為特征的一種疾病。一般來(lái)說(shuō)，高尿酸血癥和痛風(fēng)的主要原因是嘌呤代謝紊亂，黃嘌呤經(jīng)酶催化從而過(guò)度產(chǎn)生尿酸[10]。高尿酸血癥主要由腎排泄尿酸降低或過(guò)多的肝尿酸生成引起。在肝臟，黃嘌呤氧化酶可以催化次黃嘌呤氧化成黃嘌呤，進(jìn)而黃嘌呤氧化成尿酸。此外，痛風(fēng)與嘌呤降解的終產(chǎn)物即血清尿酸水平升高有關(guān)[11]。血清尿酸水平的高低是關(guān)節(jié)和腎臟尿酸鹽結(jié)晶沉積的最重要風(fēng)險(xiǎn)因素，有可能會(huì)導(dǎo)致尿路結(jié)石和痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎[12]。此前，許多中藥成分[11，13～14]已被證明具有較高黃嘌呤氧化酶抑制活性和降低血清尿酸水平的能力。

本研究通過(guò)評(píng)估血清尿酸水平、肝臟黃嘌呤氧化酶活性和腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平來(lái)研究七葉蓮總皂苷抗高尿酸血癥的作用。體外研究結(jié)果顯示，七葉蓮總皂苷低、中、高劑量均能抑制黃嘌呤氧化酶活性，并隨劑量的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。體內(nèi)研究中，與正常對(duì)照組小鼠相比，高尿酸模型小鼠的血清尿酸水平顯著升高，表明高尿酸血癥的小鼠模型復(fù)制成功。比較正常對(duì)照組和模型對(duì)照組小鼠的肝臟黃嘌呤氧化酶的活性，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著區(qū)別。這一結(jié)果表明用本研究造模方法可能不影響小鼠的黃嘌呤氧化酶活性。七葉蓮總皂苷低、中、高劑量組小鼠的血清尿酸水平、肝臟黃嘌呤氧化酶活性及腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1表達(dá)均較模型組低，并均呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

可見(jiàn)，七葉蓮總皂苷可以通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性和降低腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白URAT1表達(dá)兩種途徑發(fā)揮降尿酸的作用。該結(jié)果為七葉蓮作為降尿酸中藥的開(kāi)發(fā)利用奠定了一定基礎(chǔ)。

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