李仲均，黃麗姍，黃素然

(南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院婦產科，廣東 東莞 523059)

子癇前期是妊娠期特有的疾病，以妊娠20周后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿為主要特征。在西方發(fā)達國家發(fā)病率約為2%～8%[1]，在我國發(fā)病率約為9.4%～10.4%[2]。子癇前期是導致孕產婦和新生兒患病率和死亡率升高的重要原因之一。在全球范圍內，每年約有5萬例孕產婦死于該疾病及其并發(fā)癥[3]。子癇前期的病因和發(fā)病機制目前尚未完全闡明，可能涉及遺傳易感性、營養(yǎng)缺乏、血管內皮損傷、炎癥免疫過度激活等多種因素[4]。其中血管內皮損傷，被認為是導致子癇前期發(fā)生和發(fā)展的重要因素[5]。半乳糖凝集素-1(Galectin-1)屬于β-半乳糖苷結合蛋白家族成員，具有促進細胞生長、抑制細胞凋亡、介導細胞黏附等多種生物學功能[6]。近年的研究[7]表明，Galectin-1在參與調控細胞分化、新生血管形成、腫瘤侵襲和轉移等過程中起重要作用。Galectin-1在子癇前期疾病過程中的作用少見報道。本研究通半定量反轉錄-聚合酶鏈反應(SqRT-PCR)法、免疫組織化學SP法檢測Galectin-1在子癇前期患者胎盤組織中的表達，探討其與子癇前期疾病發(fā)生的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2014年1月至2015年9月在南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院住院分娩的子癇前期患者40例，均符合子癇前期的診斷標準[2]，其中輕度子癇前期(輕度組)25例，年齡(27.3±3.6)歲，孕次(2.3±1.2)次，孕周(28.2±1.2)周；重度子癇前期(重度組)15例，年齡(29.2±3.2)歲，孕次(2.1±1.6)次，孕周(28.5±1.3)周。選擇同期在本院住院分娩的正常妊娠孕婦(正常對照組)40例，年齡(29.1±4.5)歲，孕次(2.2±1.3)次，孕周(29.3±3.5)周。均無高血壓、糖尿病、腎病，以及其他產科并發(fā)癥。3組年齡、孕次、孕周比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑與儀器

山羊抗人Galectin-1多克隆抗體購自美國Abcam公司，小鼠抗人CD34單克隆抗體購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，EnVisionTM+System購自丹麥DAKO公司，RNAiso Plus、Taq酶均購自寶生物工程(大連)有限公司，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自立陶宛Fermentas公司。CO2培養(yǎng)箱購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司(型號：Forma3110)，光學顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司(型號：BX51)，凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司(型號：Bio-Rad ChemiDoc MP)。

1.3 研究方法

1.3.1 標本采集

胎盤娩出后10 min內取材，即從近臍帶附著處切取胎盤全層組織2塊，每塊組織大小為1 cm×1 cm×0.2 cm。用預冷的滅菌0.9%氯化鈉注射液快速沖洗3次，去除血污，其中1塊組織用滅菌濾紙吸去水分，裝入1.5 mL的EP管中，放置-80 ℃ 冰箱保存；另1塊組織放入10%中性甲醛中固定24 h，經乙醇梯度脫水，二甲苯透明浸蠟后，石蠟包埋成塊，備用。

1.3.2 SqRT-PCR法檢測胎盤組織中Galectin-1 mRNA的表達水平

將超低溫凍結的胎盤組織標本稱取50 mg，迅速置于用液氮預冷過的研缽中，在液氮中反復研磨至粉末，加入RNAiso Plus進行組織總RNA提取。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA。建立PCR反應體系：Template DNA 1 μL，F(xiàn)orward primer(10 mmol·L-1)1 μL，Reverse primer(10 mmol·L-1)1 μL，PCR Master Mix(2×)10 μL，nuclease-free water 7 μL。PCR反應條件：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 變性1 min，60 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，共30個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。PCR引物(PCR引物由上海英駿生物有限公司合成)：Galectin-1[5′-CTGAACCTGGGCAAAGACAG-3′(上游引物)，5′-GCGGTTGGGGAACTTGAATT-3′(下游引物)]、β-actin[5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′(上游引物)，5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(下游引物)]。PCR擴增產物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，GelRed染色，凝膠成像系統(tǒng)分析結果。以Galectin-1/β-actin比值代表Galectin-1 mRNA的表達水平。

1.3.3 免疫組織化學SP法檢測胎盤組織中Galectin-1的表達

將石蠟包埋成塊的胎盤組織3 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化并進行抗原修復。滴加3% H2O2室溫孵育10 min，再加入山羊抗人Galectin-1多克隆抗體(1:250稀釋)和小鼠抗人CD34單克隆抗體(即用型)，4 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜。PBS漂洗10 min，加入HRP標記二抗，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30 min，DAB顯色，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，常規(guī)脫水、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判讀由2名經驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行閱片。按文獻[8]的評分方法，再按陽性細胞所占百分比(無陽性細胞數(shù)為0分，陽性細胞數(shù)<10%為1分，陽性細胞數(shù)10%～50%為2分，陽性細胞數(shù)51%～80%為3分，陽性細胞數(shù)>80%為4分)和染色強弱(無為0分，弱為1分，中為2分，強為3分)的乘積進行免疫反應評分(IRS)，按照評分的分值判斷為陰性(0～3分)，陽性(弱+中+強，4～12分)。

1.3.4 胎盤組織中微血管密度的檢測

參照文獻[9]的方法，進行微血管密度計數(shù)：以CD34抗體標記血管內皮細胞，由2位經驗豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行閱片，在光學顯微鏡(40倍)下選取微血管密度最高的區(qū)域，然后在光學顯微鏡(400倍)下觀察5個不重復的視野，單個內皮細胞著色亦作為1個計數(shù)單位，但直徑>100 μm的血管予以剔除。計算每個視野內微血管的數(shù)目，取平均數(shù)作為微血管密度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

半定量RT-PCR結果顯示，胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達水平：正常對照組為0.131±0.029，輕度組為0.381±0.039，重度組為0.662±0.045。輕度組、重度組胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達水平均明顯高于正常對照組，重度組胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達水平明顯高于輕度組，均P<0.05。見圖1—2。

輕度組、重度組胎盤組織中Galectin-1陽性表達率均明顯高于正常對照組，重度組胎盤組織中Galectin-1陽性表達率均明顯高于輕度組，均P<0.05。見表1。

免疫組織化學結果顯示，Galectin-1主要表達于胎盤滋養(yǎng)細胞的胞質和細胞膜。見圖3封三。

表1 各組胎盤組織中Galectin-1表達率的比較

胎盤組織中微血管密度值：重度組為36.25±9.25，輕度組為52.13±6.35。重度組胎盤組織中微血管密度值明顯低于輕度組(P<0.05)。子癇前期胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達水平與微血管密度值呈負相關(r=-0.416 3，P<0.05)。

3 討論

子癇前期是嚴重危害母嬰健康的產科并發(fā)癥，對其發(fā)病機制的研究一直是產科領域的熱點。目前，有研究[10]認為，子癇前期的發(fā)生、發(fā)展是一個涉及母體、胎盤、胎兒等眾多因素的復雜病理過程。遺傳、免疫、環(huán)境等因素致滋養(yǎng)細胞功能障礙，滋養(yǎng)細胞浸潤過淺，子宮螺旋動脈重鑄不足，絨毛間質微血管形成減少，進而引起胎盤缺血、缺氧，其是子癇前期發(fā)病的始動因素。胎盤缺血、缺氧加重細胞損傷，釋放多種胎盤因子進入母體血液循環(huán)、促使炎癥免疫過度激活和血管內皮損傷是子癇前期發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。Galectin-1屬于動物凝集素家族成員，由LGALS1基因編碼，定位于22q13.1染色體[11]。Galectin-1廣泛表達于哺乳動物上皮細胞和免疫細胞的胞質和細胞膜中，可與層粘連蛋白、整合素β1亞基、細胞外基質等多種靶分子結合，發(fā)揮調節(jié)細胞生長、凋亡、黏附及炎癥免疫反應等作用。隨著研究的深入，Galectin-1在參與調控腫瘤發(fā)生、血管生成、免疫耐受等過程中的作用受到越來越多的關注[12-13]。

目前，有研究[14]發(fā)現(xiàn)，Galectin-1除了在胸腺、腎臟以及結直腸癌等惡性腫瘤組織中有較強表達外，在分泌期子宮內膜和蛻膜組織中也有一定豐度的表達。Tirado González等[15]采用ELISA法檢測早、中、晚3個不同妊娠階段共70例孕婦血清中Galectin-1的表達水平，發(fā)現(xiàn)自妊娠早期開始，孕婦外周血中Galectin-1表達水平升高，于妊娠中期到達最高峰，并維持這種高水平表達至妊娠晚期。進一步研究證實，Galectin-1最早出現(xiàn)在卵裂期和囊胚期等胚胎發(fā)育階段并普遍表達于妊娠早期和晚期各型滋養(yǎng)細胞中。Freitag等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外源性注入Galectin-1能夠改變小鼠胚胎在著床過程中因血管生成受阻，而導致發(fā)育停止。筆者通過SqRT-PCR法、免疫組織化學SP法檢測Galectin-1在子癇前期患者胎盤組織中的表達，結果顯示，輕度組、重度組胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達水平、Galectin-1陽性表達率均明顯高于正常對照組(均P<0.05)，子癇前期胎盤組織中Galectin-1 mRNA表達水平與微血管密度值呈負相關(r=-0.416 3，P<0.05)，提示Galectin-1可能通過調控胎盤微血管生成參與子癇前期的病理過程。

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