周軼冰

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）在我國是一種惡性程度極高的腫瘤，死亡率較高，其發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理、生理發(fā)展過程，由調(diào)控細(xì)胞關(guān)鍵信號通路的失調(diào)、腫瘤原癌基因的激活和抑癌基因的失活等多因素參與，通過腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移以及擴(kuò)散等多途徑發(fā)展[1]。microRNA廣泛存在于各種真核生物中，非蛋白質(zhì)編碼RNA，長度為21～23核苷酸。通過已經(jīng)被闡明的一小部分microRNA的生物學(xué)功能得知，人體的許多生理過程都有microRNA的參與，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化與先天免疫等，尤其針對病毒性肝炎、肝癌等疾病更是存在著不同的microRNA表達(dá)，對于調(diào)控癌基因和抑癌基因起著關(guān)鍵作用[2～4]。

本研究主要針對肝細(xì)胞癌患者血清中micro RNA-21和microRNA-126的表達(dá)水平及其臨床意義進(jìn)行研究，統(tǒng)計(jì)資料來源于2014年3月～2017年3月期間在我院就診的肝細(xì)胞癌患者血清標(biāo)本，選取其中20例作為實(shí)驗(yàn)組，采用qRT-PCR檢測方法對實(shí)驗(yàn)組樣本術(shù)前、術(shù)后microRNA-21和microRNA-126的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測和分析，對microRNA-21和microRNA-126在各實(shí)驗(yàn)組和健康對照組中的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1臨床資料選取2014年3月～2017年3月在我院確診的肝細(xì)胞癌且行手術(shù)治療的患者20例，取血清樣本作為本研究的實(shí)驗(yàn)組，其中乙型肝炎病毒（HBV）陽性13例，乙型肝炎病毒陰性7例；男14例，女6例，年齡38～65歲，平均（48.6±4.5）歲。HBV陽性實(shí)驗(yàn)組中ALT≤40U/L者5例，ALT＞40U/L者8例；AFP＜5μg/L者9例，AFP≥5μg/L者4例；腫瘤大小≥3cm者10例，＜3cm者3例；根據(jù)腫瘤TNM分期法對實(shí)驗(yàn)組中的樣本進(jìn)行分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期6例，Ⅲ期5例。HBV陰性實(shí)驗(yàn)組中ALT≤40U/L者6例，ALT＞40U/L者1例；AFP＜5μg/L者3例，AFP≥5μg/L者4例；腫瘤大小≥3cm者4例，＜3cm者3例；根據(jù)腫瘤TNM分期法對實(shí)驗(yàn)組中的樣本進(jìn)行分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期2例，Ⅲ期4例。選取我院健康體檢志愿者的血清樣本10例作為健康對照組，其中男6例，女4例，年齡37～65歲，平均（51.0±6.2）歲，ALT≤ 40U/L者 9例，ALT＞40U/L者1例；AFP＜5μg/L者10例。HBV陽性實(shí)驗(yàn)組、HBV陰性實(shí)驗(yàn)組和健康對照組之間的性別、年齡等基本資料差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在一些HBV-DNA定量、腫瘤大小以及腫瘤TNM分期等病理、生理資料上，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

1.2方法提取純化總microRNA采用美國Molecular Research Center公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒， 其中RT引物、上游引物、下游引物由廣州睿博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并提供[5～7]。然后通過RT-PCR 技術(shù)將microRNA單鏈逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA，其中使用的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒由Fermentas公司生產(chǎn)提供，再以此為模板通過PCR擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行DNA擴(kuò)增。最后血清樣本中microRNA-21和 microRNA-126表達(dá)水平的確定借助熒光探針法定量PCR檢測技術(shù)來實(shí)現(xiàn)[8～10]。

提取血清中microRNA的方法如下[11]：①清晨空腹時(shí)，抽取各實(shí)驗(yàn)組對象外周靜脈血2ml，為防止血細(xì)胞破裂，將試管中放入EDTA抗凝劑，再將抽取的靜脈血放入管中，輕輕搖勻，使血液充分接觸抗凝劑。②將上一步得到的試管放入冰箱，溫度設(shè)定4℃，2h內(nèi)將血漿分離。③采用上海生物有限公司生產(chǎn)的高速離心機(jī)，離心10min，將上層無色上清液小心吸出至Eppendorf管中，不可取中間白色細(xì)胞層。④將Eppendorf管中的上層無色上清液放入離心機(jī)，離心10min，使血漿進(jìn)一步分離。⑤血漿分離后可放入冰箱長期保存，溫度設(shè)定-80℃，按照每500μl的體積為一份進(jìn)行分裝。⑥提取并純化總的microRNA，具體操作方法見美國Molecular Research Center公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒說明書。⑦提取純化microRNA的濃度和純度，具體操作方法見美國Perkineliner UV紫外分光光度儀說明書。

另外，本研究入組的實(shí)驗(yàn)樣本均經(jīng)我院病理學(xué)確診為肝細(xì)胞癌，術(shù)前未經(jīng)任何放療或者化療，所有患者均接受了肝細(xì)胞癌根治性切除術(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，其中年齡、腫瘤大小、AFP、ALT等患者的定量數(shù)據(jù)資料在HBV陽性實(shí)驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后、HBV陰性實(shí)驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后與健康對照組之間的差異采用非配對t檢驗(yàn)來確定，具體數(shù)據(jù)采用±s表示，各實(shí)驗(yàn)組間microRNA-21和microRNA-126表達(dá)水平的差異則采用U檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有P均為雙側(cè)[12]。

2 結(jié)果

采用qRT-PCR方法對HBV陽性實(shí)驗(yàn)組和健康對照組中的microRNA-21和microRNA-126的表達(dá)水平進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果表明：①HBV陽性實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前microRNA-21的表達(dá)較健康對照組明顯上調(diào)，術(shù)后microRNA-21的表達(dá)較術(shù)前明顯下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②HBV陽性實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前microRNA-126的表達(dá)較健康對照組明顯下調(diào)，術(shù)后microRNA-126的表達(dá)較術(shù)前明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

采用qRT-PCR方法對HBV陰性實(shí)驗(yàn)組和健康對照組中的microRNA-21和microRNA-126的表達(dá)水平進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果表明：①HBV陰性實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前microRNA-21的表達(dá)較健康對照組明顯上調(diào)，術(shù)后microRNA-21的表達(dá)較術(shù)前明顯下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；② HBV 陰性實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)前、術(shù)后microRNA-126的表達(dá)水平與健康對照組無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表1 microRNA-21和microRNA-126在HBV陽性實(shí)驗(yàn)組與對照組中的表達(dá)（±s）

表1 microRNA-21和microRNA-126在HBV陽性實(shí)驗(yàn)組與對照組中的表達(dá)（±s）

組別 例數(shù) microRNA-21 microRNA-126健康對照組a 10 0.12±0.03 3.97±0.24 HBV陽性實(shí)驗(yàn)組術(shù)前b13 2.91±0.11 1.18±0.16 HBV陽性實(shí)驗(yàn)組術(shù)后c13 0.22±0.07 2.89±0.23 tab 4.12 3.53 Pab 0.001 0.001 tbc 3.91 3.15 Pbc 0.002 0.001

表2 microRNA-21和microRNA-126在HBV陰性實(shí)驗(yàn)組與對照組中的表達(dá)（±s）

表2 microRNA-21和microRNA-126在HBV陰性實(shí)驗(yàn)組與對照組中的表達(dá)（±s）

健康對照組a 10 0.12±0.03 3.97±0.24 HBV陰性實(shí)驗(yàn)組術(shù)前b 7 1.64±0.21 2.10±0.52 HBV陰性實(shí)驗(yàn)組術(shù)后c 7 0.32±0.05 3.16±0.20 tab 3.75 1.83 Pab 0.002 0.09 tbc 3.24 1.25 Pbc 0.003 0.10

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，血清中的microRNA-21和microRNA-126非常穩(wěn)定，即使在反復(fù)凍融、煮沸以及長期儲存等處理環(huán)境中也不會發(fā)生降解，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測分析得到的microRNA-21和microRNA-126表達(dá)比較穩(wěn)定。

microRNA-21不管在HBV陽性實(shí)驗(yàn)組還是陰性實(shí)驗(yàn)組中術(shù)前的表達(dá)水平較健康對照組都有明顯上調(diào)，而術(shù)后實(shí)驗(yàn)組中microRNA-21的表達(dá)水平較術(shù)前有明顯下調(diào)，由此推測，microRNA-21有可能為早期肝癌提供無創(chuàng)診斷依據(jù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，microRNA-21在HBV陽性實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)水平明顯高于HBV陰性實(shí)驗(yàn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這是因?yàn)閙icroRNA的表達(dá)譜在從HBV感染發(fā)生到肝細(xì)胞癌的演變進(jìn)程中不斷地發(fā)生變化，往往在進(jìn)程的早期這種變化更加明顯，所以microRNA-21的表達(dá)水平明顯上調(diào)會發(fā)生在HBV感染階段，推測肝細(xì)胞受到HBV感染刺激，主動(dòng)分泌microRNA-21，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)組血清中microRNA-21的表達(dá)水平明顯上調(diào)，且從HBV感染發(fā)生到肝細(xì)胞癌的演變進(jìn)程中逐漸升高。希望將來可以增加研究的樣本例數(shù)、擴(kuò)大研究范圍，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測分析microRNA-21，得到microRNA-21的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定microRNA-21正常值和異常值表達(dá)水平的數(shù)學(xué)曲線。

本研究表明，microRNA-126在HBV陽性肝癌患者實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平較健康對照組有明顯下調(diào)，而術(shù)后其表達(dá)水平較術(shù)前有明顯上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。microRNA-126在HBV陰性實(shí)驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后和健康對照組中的表達(dá)水平均無顯著差異。有研究發(fā)現(xiàn)[13～15]，在結(jié)直腸癌和乳腺癌中EGFL-7作為microRNA-126的宿主基因，上游啟動(dòng)子存在甲基化現(xiàn)象，這種現(xiàn)象導(dǎo)致microRNA-126的表達(dá)水平明顯下調(diào)，如果去甲基化處理上游啟動(dòng)子，microRNA-126的表達(dá)水平將會明顯上調(diào)，所以我們推測引起microRNA-126表達(dá)水平下調(diào)的主要原因可能是EGFL-7上游啟動(dòng)子甲基化。

綜上所述，在 HBV 陽性實(shí)驗(yàn)組血清樣本中microRNA-21和microRNA-126的表達(dá)存在異常，在HBV陰性肝癌患者實(shí)驗(yàn)組血清樣本中microRNA-21的表達(dá)也有顯著性差異，這些研究表明microRNA-21可以作為肝癌早期無創(chuàng)診斷的血清標(biāo)記物， microRNA-126也可以為HBV陽性肝癌的早期診斷提供依據(jù)，而且可以用于評價(jià)手術(shù)治療效果，但是microRNA-21和microRNA-126并不具有肝癌血清標(biāo)記物的特異性，它們能否準(zhǔn)確的在肝癌早期作為無創(chuàng)診斷的血清標(biāo)記物還有待更多試驗(yàn)樣本量的證實(shí)，尤其是要描繪microRNA-21正常值和異常值表達(dá)水平的數(shù)學(xué)曲線更需要增加研究的樣本例數(shù)、擴(kuò)大研究范圍。

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