嚴(yán)俊杰 仝宗軍 劉媛媛 張磊 張?jiān)?謝寶貴

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心，福州 350002）

草菇（Volvariella volvacea）又稱中國(guó)蘑菇，是一類重要的高溫褐腐型食用菌，在熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植［1］。草菇可以利用稻草、廢棉、玉米芯、甘蔗渣、藥渣以及各種食用菌栽培菌渣等為主料進(jìn)行栽培，不僅可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢料的再次利用，還可帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，變廢為寶［2-3］。然而，草菇的生物轉(zhuǎn)化率較低，通常只能達(dá)到20%左右，制約了草菇的高效生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［4］。對(duì)基質(zhì)降解相關(guān)酶及其編碼基因的研究與改造以提高草菇基質(zhì)降解能力是提高其生物轉(zhuǎn)化率的有效手段。

植物組織是草菇栽培料的重要組成成分，也是草菇碳源的主要來源。在植物組織中，木質(zhì)素和半纖維素以共價(jià)鍵形式接合，將纖維素分子包埋于其中，形成堅(jiān)固的天然屏障，阻礙了微生物進(jìn)入其中分解纖維素［5］。因此，木質(zhì)素降解能力的高低是決定草菇能否高效利用纖維素獲取子實(shí)體發(fā)育所需碳源的關(guān)鍵。芳香醇氧化酶（Aryl alcohol oxidase，AAO，EC 1.3.3.7）屬于 GMC（Glucose-methanol-choline）氧化還原酶超家族，是一種分泌型黃素蛋白酶，其氧化苯甲醇釋放出來的過氧化氫可以與過氧化物酶及漆酶相互作用形成羥基自由基用于降解木質(zhì)纖維素；同時(shí)，AAO還可以抑制漆酶氧化產(chǎn)物的再聚合，以維持對(duì)木質(zhì)纖維素的持續(xù)降解［6］。隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，已有大量食用菌的芳香醇氧化酶編碼基因獲得注釋［7］。Varela等［8］在 2000 年成功解析出側(cè)耳屬Pleurotus pulmonarius的AAO晶體結(jié)構(gòu)，這為食用菌AAO的結(jié)構(gòu)及木質(zhì)素降解機(jī)制研究提供了重要的參考。本實(shí)驗(yàn)室已對(duì)草菇同核體菌株P(guān)Yd21的基因組進(jìn)行了de novo測(cè)序，并對(duì)同、異核體菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜及蛋白質(zhì)組測(cè)序［9，10］。基于這些組學(xué)數(shù)據(jù)，我們獲得了一個(gè)芳香醇氧化酶編碼基因vvaao1，并對(duì)其序列特征、表達(dá)情況進(jìn)行系統(tǒng)的分析，以期為深入研究vvaao1在草菇基質(zhì)降解和子實(shí)體發(fā)育過程中的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試草菇菌株P(guān)Yd21、PYd15為福建省主栽品種“屏優(yōu)一號(hào)”兩個(gè)可正常配對(duì)的單孢，配對(duì)純化后獲得雜交菌株H1521。對(duì)PYd21菌絲進(jìn)行DNA提取并采用Illumina平臺(tái)進(jìn)行de novo測(cè)序，SOAPdenovo拼接結(jié)果上傳至NCBI，登錄號(hào)為：PRJNA171553。對(duì)PYd21、PYd15、H1521菌絲以及H1521的子實(shí)體菌柄樣品等量混合后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；并對(duì)3個(gè)菌株分別進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜（Digital gene expression profiling，DGE）及蛋白質(zhì)組（iTRAQ）測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 基因序列獲取與結(jié)構(gòu)分析 以基因組注釋獲得的vvaao1序列及其上下游2 000 bp為參考（Reference sequence），采用 ZOOM 軟件［11］將混合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的clean reads與之定位獲取轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)區(qū)段；以全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本及其上下游500 bp為reference進(jìn)行基因組 reads定位，驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性；驗(yàn)證準(zhǔn)確的序列再次進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組reads定位，對(duì)reads規(guī)律性錯(cuò)配區(qū)域進(jìn)行分析并結(jié)合GT-AG保守結(jié)構(gòu)判斷內(nèi)含子位置；軟件設(shè)置與內(nèi)含子判斷按照嚴(yán)俊杰等的方法進(jìn)行［12］，基因組reads定位時(shí)設(shè)置錯(cuò)配堿基數(shù)為0，轉(zhuǎn)錄組reads定位設(shè)置錯(cuò)配堿基數(shù)為40。獲得DNA序列的相關(guān)信息后，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)模擬圖繪制。

1.2.2 氨基酸序列生物信息學(xué)分析 氨基酸序列的理化性質(zhì)采用Expasy ProtParam（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）分析，采用SignalP-4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測(cè)信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位采用TargetP 1.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/） 分 析；蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的比較分析采用Phyre 2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？ id=index） 進(jìn)行 ；從 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）、UniProt（http://www.uniprot.org/）網(wǎng)站獲取白腐真菌GMC氧化還原酶超家族氨基酸序列，同時(shí)根據(jù)文獻(xiàn)信息［13］下載目前已報(bào)道具備AAO序列的三個(gè)褐腐 菌（Gloeophyllum trabeum、Fomitopsis pinicola及Rhodonia placenta）基因組數(shù)據(jù)，并獲取相應(yīng)的AAO氨基酸序列，應(yīng)用MEGA 5.1［14］進(jìn)行MUSCLE法比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹分析。

1.2.3vvaao1轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)分析 應(yīng)用ZOOM軟件將PYd15、PYd21、H1521三個(gè)菌株的數(shù)字基因表達(dá)譜clean tags與vvaao1基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行定位，設(shè)置錯(cuò)配為0。參照劉朋虎等［15］進(jìn)行表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化及差異表達(dá)分析，獲得vvaao1在不同菌株的TPM值（transcript per million clean tags）。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證vvaao1基因的表達(dá)模式。收集固體PDA上生長(zhǎng)相同時(shí)間的菌絲樣品以及H1521不同發(fā)育時(shí)期的子實(shí)體樣品，液氮速凍后用于總RNA提取。分別采用E.Z.N.A.TMPlant RNA kit試劑盒（美國(guó)Omega Bio-Tek公司）和TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One Step gDNA Removeal）試劑盒（北京全式金公司）提取總RNA并進(jìn)行第一鏈cDNA合成，操作均按照說明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光PCR采用TransStart Top Green qPCR SuperMix（北京全式金公司）定量試劑盒，在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD公司）進(jìn)行，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因vv-gapdh為內(nèi)參，退火溫度設(shè)為60℃，循環(huán)數(shù)設(shè)為40。應(yīng)用Primer 6.0設(shè)計(jì)定量PCR引物并委托上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。每種樣品進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法［16］計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表 1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR所使用的引物

1.2.4vvaao1翻譯水平的差異表達(dá)分析 采用iTRAQ獲得草菇蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，以草菇PYd21的基因組序列預(yù)測(cè)獲得的氨基酸序列為模版，應(yīng)用PEAKS stutio6.0軟件［17］，將帶有不同iTRAQ標(biāo)記的肽段進(jìn)行匹配，并獲得可視化的蛋白相對(duì)表達(dá)量。具體參數(shù)設(shè)置參見文獻(xiàn)［18］。

1.2.5 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定與出菇試驗(yàn) 參考王圣銪等［19］的方法配制大試管栽培料，高壓滅菌后打孔接種活化兩次后的草菇菌絲，于34℃避光培養(yǎng)；參照朱堅(jiān)等［20］的方法測(cè)定菌絲在栽培料上的生長(zhǎng)速度；參考陸娜等［21］的方法進(jìn)行栽培料制作和出菇管理。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用 SPSS 2.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異顯著性用 LSD方法進(jìn)行分析比較。采用皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient）分析菌絲生長(zhǎng)速度與vvaao1表達(dá)量的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 vvaao1基因序列驗(yàn)證與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)基因組注釋結(jié)果，vvaao1序列位于scaffold 37上52 319-54 654 bp之間，全長(zhǎng)2 336 bp。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組reads定位后獲得vvaao1序列的實(shí)際全長(zhǎng)為3 091 bp，與預(yù)測(cè)序列相比5'UTR區(qū)域和3'UTR區(qū)域分別延長(zhǎng)了278 bp和477 bp。將基因組測(cè)序獲得的clean reads與上下游分別延長(zhǎng)500 bp后的DNA序列進(jìn)行定位，結(jié)果如圖1所示，vvaao1基因的全長(zhǎng)均被reads所覆蓋，最低覆蓋reads數(shù)為7條，說明vvaao1的DNA序列正確，可以用于后續(xù)分析。

圖1 基因組reads與vvaao1序列的定位情況

對(duì)基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果如圖2所示：vvaao1有9個(gè)外顯子，編號(hào)為E1-E9；8個(gè)內(nèi)含子，編號(hào)為I1-I8，內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為：53、52、55、55、49、55、61、153 bp。將去除所有內(nèi)含子的轉(zhuǎn)錄本提交ORF Finder，預(yù)測(cè)獲得一條完整的開放閱讀框（ORF），全長(zhǎng)1 803 bp，5'端非翻譯區(qū)（5'UTR）長(zhǎng)度為278 bp；3'端非翻譯區(qū)（3'UTR）全長(zhǎng)477 bp。基因及氨基酸編碼序列均上傳NCBI，并獲得GenBank登錄號(hào)為MG938583。

2.2 VvAAO1蛋白的生物信息學(xué)分析

圖2 草菇vvaao1基因結(jié)構(gòu)模擬圖

草菇VvAAO1蛋白由600個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為65 kD，理論等電點(diǎn)為4.49。信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果如圖3所示：VvAAO1氨基酸序列的N端包含一段18個(gè)氨基酸殘基的分泌信號(hào)肽，屬于分泌蛋白。亞細(xì)胞定位的結(jié)果也支持該蛋白位于分泌通路（Secretory pathway），得分（NN scores）為0.906，RC值（Relative Class）為2。推測(cè)該蛋白可能通過N端信號(hào)肽引導(dǎo)分泌到細(xì)胞外行使其生物學(xué)功能，這與芳香醇氧化酶家族的特征相吻合。

圖3 VvAAO1氨基酸序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

以PDB（Protein data bank）數(shù)據(jù)庫(kù)上二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)已獲得解析的Pleurotus eryngii芳香醇氧化酶模式蛋白3FIM為參考，對(duì)VvAAO1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。結(jié)果如圖4-A所示，成熟的VvAAO1蛋白包含20個(gè)α-螺旋和19個(gè)β-折疊。與3FIM相比，一致性（Identity）達(dá)到48%，置信度（Confidence）達(dá)到100%；其中，3FIM的預(yù)測(cè)結(jié)果（3FIM-predict）在第205、355個(gè)氨基酸附近較VvAAO1多了一個(gè)α-螺旋，在第500個(gè)氨基酸附近多了一個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)，其余結(jié)構(gòu)基本一致（圖4-A，C）；然而，3FIM的預(yù)測(cè)結(jié)果與其自身的實(shí)際結(jié)構(gòu)（3FIM-real）仍存在一些差異（圖4-B，4-C）。

圖4 VvAAO1與芳香醇氧化酶模式蛋白3FIM的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較

采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示：所有38條真菌GMC超家族蛋白可以分為AAO、PDH、MOX、CDH、POX四個(gè)家族分支，自檢1 000次的bootstrap值均在97%以上。草菇VvAAO1序列位于AAO家族分支上，與側(cè)耳屬菌株P(guān). eryngii和P. pulmonarius的AAO序列最為接近，但與褐腐菌Gloeophyllum trabeum、Fomitopsis pinicola及Rhodonia placenta的AAO序列關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 草菇vvaao1基因在不同菌株之間的差異表達(dá)

PYd15、PYd21及H1521的表達(dá)譜分別有263、3和13 453個(gè)Clean Tag能夠正向定位于vvaao1的轉(zhuǎn)錄本上，得到標(biāo)準(zhǔn)化后的TPM值分別為：45.71、0.51、2 359.43；熒光定量PCR的結(jié)果（圖6-A）顯示H1521的表達(dá)量是PYd15的167倍、PYd21的71倍。蛋白質(zhì)組iTRAQ數(shù)據(jù)也支持H1521的表達(dá)量最高且是兩個(gè)同核體菌株之和的2.13倍，存在協(xié)同增效作用（圖6-B）。

2.4 菌絲在栽培料上的生長(zhǎng)速度與出菇能力

如圖6-C所示，H1521在栽培料上生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)速度為1.2 cm/d，是PYd15的1.46倍，是PYd21的7.50倍；PYd21的生長(zhǎng)速度最慢，僅為0.16 cm/d。菌絲生長(zhǎng)速度與vvaao1的DGE、RT-qPCR以及iTRAQ結(jié)果的皮爾森相關(guān)系數(shù)為分別為：0.789、0.774及0.758，均達(dá)到強(qiáng)相關(guān)水平。3個(gè)菌株的出菇情況如圖6-D-F所示，僅H1521能夠出菇，PYd15及PYd21的料面菌絲稀少均無(wú)法形成原基。

2.5 vvaao1在草菇不同發(fā)育時(shí)期的差異表達(dá)

圖5 VvAAO1與真菌GMC氧化還原酶超家族序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

對(duì)異核體菌株H1521進(jìn)行出菇并取樣。結(jié)果如圖7-A-E所示，草菇子實(shí)體發(fā)育可以分為原基、紐扣期、蛋形期、伸長(zhǎng)期和成熟期5個(gè)時(shí)期；其中，蛋形期、伸長(zhǎng)期和成熟期具有菌蓋和菌柄的明顯分化，分別取樣。對(duì)以上樣品進(jìn)行RT-qPCR分析，結(jié)果如圖7-F所示：vvaao1在原基的表達(dá)量最高，且與其他各個(gè)時(shí)期均存在顯著性差異，在成熟期的樣品中幾乎不表達(dá)；另外，vvaao1在同一時(shí)期的菌蓋和菌柄的表達(dá)量差異不顯著。

3 討論

基質(zhì)降解能力的強(qiáng)弱直接關(guān)系到食用菌栽培的產(chǎn)量和效益。草菇作為褐腐真菌，具備較為完善的纖維素降解系統(tǒng)［9］；然而，前期的研究結(jié)果表明，草菇缺乏錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶活性，僅具備漆酶活性，對(duì)木質(zhì)素的降解能力較弱，是草菇降解基質(zhì)、吸收營(yíng)養(yǎng)的限制因子，也是草菇生物轉(zhuǎn)化率低的原因之一［4，22］。木質(zhì)素主要由芳香醇聚合而成［23］，作為木質(zhì)素降解的輔酶，芳香醇氧化酶可以分泌到細(xì)胞外，與漆酶協(xié)同降解木質(zhì)素［24］。Carro等［13］2016年對(duì)真菌芳香醇氧化酶的研究進(jìn)行了綜述，發(fā)現(xiàn)AAO在白腐菌中的分布更為廣泛，褐腐菌僅Gloeophyllum trabeum、Fomitopsis pinicola及Rhodonia placenta的基因組中存在1-2個(gè)AAO編碼基因。本研究首次從褐腐菌草菇中獲得一個(gè)芳香醇氧化酶基因vvaao1，其編碼的蛋白具備信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位與分泌途徑，可以有效分泌到細(xì)胞外降解基質(zhì)中的木質(zhì)素；系統(tǒng)發(fā)育樹和三級(jí)結(jié)構(gòu)均顯示VvAAO1與白腐菌P.eryngii芳香醇氧化酶模式蛋白3FIM比較相似，且蛋白的大小、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)也比較接近［25］，推測(cè)草菇VvAAO1可能具備與3FIM較為接近的酶學(xué)功能。

圖6 不同草菇菌株的生長(zhǎng)、出菇及vvaao1基因的表達(dá)情況

圖7 vvaao1基因在草菇H1521不同子實(shí)體發(fā)育階段的差異表達(dá)

不同藥物或外源分子與病毒或毒素之間的互作可以有效增強(qiáng)對(duì)機(jī)體的侵染和毒效，產(chǎn)生協(xié)同增效作用［26-27］。本研究發(fā)現(xiàn)vvaao1基因的表達(dá)量在兩個(gè)同核體菌株交配后顯著上調(diào)，且遠(yuǎn)高于兩個(gè)同核體菌株表達(dá)量之和。進(jìn)一步用DNAMAN比對(duì)PYd15與PYd21的vvaao1基因開放閱讀框及其上游2 000 bp調(diào)控區(qū)的DNA序列，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)菌株的序列完全一致，說明協(xié)同增效作用并不是其自身序列的作用結(jié)果；因?yàn)榫z階段的細(xì)胞核并未發(fā)生融合，推測(cè)有可能是細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)錄因子蛋白不同亞基的互作促進(jìn)了下游基因的表達(dá)。這種異核體菌株基因發(fā)生協(xié)同增效表達(dá)的現(xiàn)象在草菇中較為常見［15，18，28-30］，然而其作用機(jī)制仍進(jìn)一步探索和揭示。另外，vvaao1基因在可正常出菇的異核體菌株H1521中表達(dá)量顯著高于兩個(gè)不能出菇的同核體菌株，且對(duì)子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的定量檢測(cè)結(jié)果也顯示該基因在子實(shí)體形成的原基期最高表達(dá)；推測(cè)vvaao1的高表達(dá)可能有利于草菇子實(shí)體的形成。

4 結(jié)論

草菇芳香醇氧化酶VvAAO1為分泌蛋白，氨基酸序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)與白腐菌P.eryngii芳香醇氧化酶模式蛋白3FIM接近；該酶的編碼基因在可正常出菇的異核體菌絲中存在協(xié)同增效表達(dá)，且在子實(shí)體發(fā)育過程的原基期最高表達(dá)。

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