秦楠 劉羽 王力宇

（山西中醫(yī)藥大學制藥與食品工程學院，太原 030619）

雞腿菇，別名毛頭鬼傘，美味可口，富含多種營養(yǎng)物質，是十分有益于健康的理想食物。雞腿菇包含了大量人體必須的營養(yǎng)物質［1-2］。通過液體發(fā)酵生產雞腿菇液體菌種和菌絲體，不僅可以避免常規(guī)固體培養(yǎng)產量低、易污染等缺點，而且發(fā)酵后得到的發(fā)酵液和菌絲在蛋白質、脂肪、纖維等營養(yǎng)成分上一般優(yōu)于或與子實體的營養(yǎng)成分相當［3］。此外，其具有多種生物學功能，如抗氧化、抗菌、降血糖、降血脂、提高免疫活性、抗腫瘤和抗病毒等作用［4-5］。近來食用真菌的抗氧化作用開始日益受到關注，其開發(fā)應用越來越受到重視。

有研究報道，采用不同的方法從雞腿菇內提取出多糖，然后將該多糖以一定量注射到小鼠體內，探究其是否能夠提高小鼠的免疫能力。經過實驗證實，該多糖作用于小鼠后，明顯增強了其免疫能力，說明雞腿菇多糖的確具有提高免疫活性的作用［6-9］。雞腿菇具有抗菌功效，還可產生某種對真菌具有抑制作用的抗菌物質，其有可能代替部分抗生素成為新型的抗菌物質。劉鳳珠等［10］報道研究了雞腿菇對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌有一定的抑制作用，同時以雞腿菇為主要組分制成涂被液進行櫻桃保鮮實驗測定了櫻桃失重率、爛果率、Vc含量等指標，表明處理組的櫻桃好果率比對照提高38%。吳艷兵［11］已經從雞腿菇中分離出一種具有抗病毒功效的多糖，對植物病毒有一定的拮抗作用。Wu等［12］從雞腿菇子實體中分離純化出一種抗性蛋白Y3，對煙草花葉病毒的抑制率達50%。王學仁［13］通過雞腿菇菌絲體發(fā)酵分離出抗性蛋白Y3，并在基因表達方面做進一步的研究。戴兵等［14］研究香菇菌絲C91-3發(fā)酵液蛋白（LFP91-3）對小鼠膜水型宮頸癌細胞株U14有明顯的抑制作用。

目前，國內外學者對雞腿菇多糖研究相對較多，而對于其生物活性蛋白的研究較少，本實驗旨在通過液體發(fā)酵分離出抗菌蛋白，能夠成功應用于食品防腐保鮮等方面。以雞腿菇為出發(fā)菌株，對發(fā)酵時間、溫度、pH、接種量、轉速等條件進行單因素試驗，并通過方差分析從中選出影響顯著的因子進行響應面設計，從面獲得抗菌蛋白的最佳發(fā)酵條件，同時對抗菌蛋白的抗氧化活性進行了研究，為后期工業(yè)化生產和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雞腿菇（Coprinus comatus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由山西中醫(yī)藥大學制藥與食品工程實驗室供。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA種子培養(yǎng)基；PDA加富培養(yǎng)基；NA牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）：美國Sigma公司；Tris、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、過氧化氫、3，5-二硝基水楊酸、無水乙醇、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、濃鹽酸和氫氧化鈉等均為分析純：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.4 儀器設備 YXQ-SG46-280S手提式高壓蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋：金壇市科技儀器有限公司；TS-211B臥式恒溫搖床：上海善志儀器設備有限公司；高速組織搗碎機：南京皓海儀器儀表公司；pHS- 25型數顯酸度儀：武漢博文電子有限公司；752型紫外分光光度計：上海光譜儀器有限公司；電子天平：上海精密儀器儀表有限公司；TGL-20B離心機：上海安亭科學儀器廠；磁力攪拌器：北京金紫光儀器儀表公司；RE-522AA式旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50冷凍干燥機：上海歐蒙實業(yè)有限公司。移液槍（范圍100-1 000 mL、20-200 mL、0.5-10 mL）德國Eppendorf公司；牛津杯：外徑7.8±0.1 mm，內徑6.0±0.1 mm，高10.0±0.1 mm。

1.2 方法

1.2.1 雞腿菇發(fā)酵液的制備 用接種環(huán)挑取一環(huán)雞腿菇母種菌絲體接入裝有150 mLPDA種子培養(yǎng)基的三角瓶中于25℃，100 r/min，搖床培養(yǎng)5 d，即可得到種子培養(yǎng)液，用無菌吸管吸取一定量的種子培養(yǎng)液加入到裝有30 mL PDA加富培養(yǎng)基的三角瓶里，然后將該三角瓶放入恒溫搖床內發(fā)酵培養(yǎng)，即可得到雞腿菇菌絲發(fā)酵液，備用。

1.2.2 抗菌蛋白的制備 用移液槍吸取制備好的雞腿菇菌絲發(fā)酵液轉移至EP管中離心，在4℃、3 000 r/min條件下離心15 min去除沉淀，經孔徑0.22 μm細菌過濾器過濾，即得無菌體培養(yǎng)濾液。緩慢加入硫酸銨至50%飽和度，用磁力攪拌器攪拌，4℃靜置2 h，8 000 r/min、離心30 min，收集沉淀蛋白。用原1/10體積0.02 mol/L pH 6.8的Tris緩沖液溶解，裝入透析袋后采用濃度相同的Tris緩沖液透析過夜，即得到雞腿菇抗菌蛋白，備用。以枯草芽孢桿菌為指示菌，采用牛津杯法測定抑菌活性。

1.2.3 指示菌菌懸液的制備 用接種針挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌接入裝有5 mL滅菌生理鹽水的試管中稀釋102倍后制成濃度為1.0×106個/mL 的孢子懸液，備用。

1.2.4 雞腿菇抗菌蛋白的抗菌能力測定 牛津杯法［16］：在無菌操作條件下，向已滅過菌的干燥的培養(yǎng)皿中傾倒15-20 mL指示菌固體培養(yǎng)基（NA），待其凝固后，用移液槍向上述培養(yǎng)皿中加入0.2 mL枯草芽孢桿菌指示菌菌懸液，用無菌涂布器涂勻。在培養(yǎng)皿中放置牛津杯，每個牛津杯中加0.2 mL的供試菌雞腿菇抗菌蛋白。將培養(yǎng)皿平穩(wěn)置于4℃冰箱，擴散24 h后再置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5 d后取出培養(yǎng)皿測量抑菌圈直徑（mm）并記錄。每組試驗重復3次取平均值，抑菌圈直徑的大小來表征抑菌活性，以無菌水為對照。

1.2.5 單因素影響試驗 本試驗選擇了不同發(fā)酵時間、溫度、pH、接種量、搖床轉速進行單因素試驗，按照1.2.2制得的抗菌蛋白進行抗菌能力的測定，記錄抑菌圈直徑作為指標。不同因子梯度條件見表1。

表1 單因素水平設計表

1.2.6 響應曲面法試驗設計 基于單因素試驗結果，選用中心組合試驗Box-Behnken設計方案，選取發(fā)酵時間（d）、接種量（%）以及轉速（r/min）3個變量，以A、B、C來表示，并以+1、0、-1分別代表其變量的水平，按方程x =（X-X0）/△X對自變量進行編碼，其中，x 表示變量的編碼值，X 表示變量的真實值，X0表示試驗中心點變量的真實值，△X表示變量的步長變化，抗菌蛋白的抑菌圈直徑Y表示響應值，見表2。

表2 中心組合試驗Box-Behnken設計因素和水平編碼值

1.2.7 抗氧化活性的測定 將雞腿菇抗菌蛋白冷凍濃縮干燥，進行不同質量濃度梯度的稀釋，采用DPPH法、ABTS法、fenton法清除· OH，測定抗菌蛋白的抗氧化活性［17］，以VC作陽性對照。

1.2.8 數據分析 本試驗所有的試驗數據均使用Origin和Design-Expert（version8.0.6）統(tǒng)計軟件進行數據處理，運用最小差異顯著法（LSD）進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發(fā)酵時間對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響 由圖1所示，在培養(yǎng)初期發(fā)酵產物較少，隨培養(yǎng)時間的延長，雞腿菇抗菌蛋白的抑菌圈直徑先增后降，發(fā)酵時間對其影響極顯著（P＜0.01），在5 d時達到最大（20.54±1.26）mm。培養(yǎng)時間繼續(xù)延長，該菌株由穩(wěn)定期進入降速期，菌數量逐漸減少，分泌抗菌蛋白能力降低導致抑菌活性逐漸減弱。

圖1 發(fā)酵時間對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響 由圖2所示，隨溫度升高，抗菌能力由弱到強，接著又變弱，發(fā)酵溫度對其影響顯著（P＜0.05），當溫度達到24℃時抗菌能力最強，抑菌圈直徑（18.72±0.9）mm。這是由于雞腿菇菌絲的生長增殖與產物積累隨溫度的升高而減少，因此溫度過高對雞腿菇菌絲的生長不利。

圖2 發(fā)酵溫度對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響

2.1.3 pH對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響 由圖3所示，抗菌能力隨pH值增加呈現(xiàn)先增后降的趨勢，pH值對其影響顯著（P＜0.05）。在pH 3-5之間，抗菌蛋白抗菌能力相對較弱；在pH6-7之間，抑菌圈直徑明顯增大，pH7時抗菌能力最強，抑菌圈直徑（17.43±051）mm；此后，抗菌能力隨著pH的繼續(xù)增加開始減弱。結果表明，雞腿菇菌絲抗菌蛋白對過酸和過堿的條件都比較敏感，抗菌能力受到抑制。

圖3 pH對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響

2.1.4 接種量對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響 由圖4所示，雞腿菇抗菌蛋白的抗菌能力隨接種量提高呈現(xiàn)不斷增強并緩慢減弱的趨勢，接種量對其影響極顯著（P＜0.01），接種量為5%時抗菌能力最強，抑菌圈直徑達（20.14±1.06）mm。隨著接種量的繼續(xù)增大，抗菌能力開始出現(xiàn)減弱的趨勢，這是由于在培養(yǎng)基內，菌數量的增大導致分泌的抗菌蛋白隨之增多。但當接種量達到一定值后再繼續(xù)增加其接種量，會導致菌群過于密集產生空間與營養(yǎng)競爭，從而影響生長發(fā)育。

圖4 接種量對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響

2.1.5 搖床轉速對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響 由圖5所示，雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力隨著搖床轉速的加快呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，搖床轉速對其影響極顯著（P＜0.01），在轉速為100 r/min 抗菌能力最強，抑菌圈直徑為（20.74±0.74）mm。這是由于搖床發(fā)酵培養(yǎng)可增加通氣量，所以隨著搖床轉速的增大，菌絲生長愈加旺盛。但當搖床轉速達到一定值后再繼續(xù)增大搖床轉速則會導致一部分菌體溶解，影響菌絲數量，導致抗菌蛋白產量隨之減少，影響了其抗菌能力。

圖5 搖床轉速對雞腿菇抗菌蛋白抗菌能力的影響

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果 如表3所示，17 個試驗點由12 個析因點和5 個零點組成，析因點是自變量取值在A、B、C所構成的三維頂點，零點表示區(qū)域的中心點，其中重復零點試驗5次，用來估算試驗中的誤差。

表3 Box-Behnken設計方案及抑菌直徑

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗 通過Design-Expert（version8.0.6，）軟件對表3實驗數據進行處理，獲得抑菌圈直徑（Y）對發(fā)酵時間（A）、接種量（B）和轉速（C）的二次多項回歸模型為：

從方差分析表4中得出模型F值為20.45，對應的P＜0.05，達到顯著水平，失擬項的P=0.3319＞0.05不顯著，說明該模型擬合程度較好，試驗誤差較小，可以用此模型來推測雞腿菇抗菌蛋白發(fā)酵條件對抗菌能力的影響。

根據模型方程繪制響應面圖，分別見圖6。其中每個響應面分別代表兩個變量在恒定值（取零水平值）下，另外兩個獨立變量之間的相互作用。

圖6-A顯示可以得知，接種量與發(fā)酵時間對抑菌圈直徑的交互作用不顯著。隨著發(fā)酵時間逐漸延長和接種量增大情況下，抑菌圈直徑先增大然后減小。當接種量5%-5.5%，發(fā)酵時間4-5 d時，抑菌圈直徑達到最大值。如圖6-B所示，轉速和發(fā)酵時間對抑菌圈直徑的交互作用不顯著，隨著發(fā)酵時間逐漸延長和轉速增加，抑菌圈直徑逐漸增大，轉速在100-125 r/min，培養(yǎng)5-5.55 d時達到最大，之后，與轉速與時間呈負相關。通過響應面分析，響應面的坡度較陡，轉速和接種量的交互作用對抑菌圈直徑有顯著影響（P＜0.05），如圖6-C所示，抑菌圈直徑隨著轉速與接種量增加而增大，當轉速達到125 r/min，接種量達到5.5%時增長趨勢變緩，開始呈現(xiàn)下降的趨勢。

表4 二次回歸模型的方差分析結果

2.2.3 抗菌蛋白的抑菌試驗 在單因素試驗基礎上，采用響應面設計得到提取雞腿菇菌絲發(fā)酵液抗菌蛋白的最佳條件為：pH7、接種量5%、溫度24℃、時間5 d、轉速為100 r/min。在上述條件下培養(yǎng)雞腿菇菌絲發(fā)酵液，經離心過濾，鹽析，透析后得到雞腿菇抗菌蛋白，設置3個重復。采用1.5.4方法培養(yǎng)后，抑菌圈直徑均值為21.14 mm，與預測值21.54 mm擬合度良好，與無菌水對照見圖7。

2.3 抗氧化活性的測定

2.3.1 DPPH自由基清除率的測定 如圖8所示，隨著抗菌蛋白質量濃度的增大，對DPPH自由基的清除能力逐漸增大，當抗菌蛋白質量濃度為0.1-0.4 mg/mL范圍內，對DPPH自由基的清除率顯著增大。當質量濃度大于0.4 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率隨質量濃度增加而減弱，但與同質量濃度的VC標準品相比，抗菌蛋白清除DPPH自由基的能力明顯較弱。通過方差分析表明，各質量濃度間對DPPH自由基的清除能力的差異顯著，在一定質量濃度范圍內抗菌蛋白與清除能力表現(xiàn)出劑量（質量濃度）-效應關系。

圖6 兩因素交互作用對抑菌圈直徑的影響

圖7 抗菌蛋白的抑菌活性

圖8 不同濃度抗菌蛋白對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 ABTS自由基清除率 如圖9所示，抗菌蛋白對ABTS自由基的清除能力隨質量濃度的增大呈現(xiàn)出先增后減趨勢。當質量濃度為0.4 mg/mL時，清除率達到最大值42.63%，統(tǒng)計分析表明，此時的清除率顯著高于其他質量濃度；質量濃度繼續(xù)增大，ABTS自由基清除率則呈下降趨勢。與同質量濃度的VC標準品相比，抗菌蛋白清除ABTS自由基能力相對較弱。

圖9 不同濃度抗菌蛋白對ABTS自由基的清除作用

2.3.3 ·OH清除率 如圖10所示，在濃度0.1-0.6 mg/mL范圍內服從線性分布y=3.678 6+64.929x，（R2=0.987 2），質量濃度0.1-0.6 mg/mL的抗菌蛋白對羥自由基清除率隨著其質量濃度的增加而增加，說明抗菌蛋白對羥自由基清除力的大小與其質量濃度呈現(xiàn)正相關。與同質量濃度的VC標準品相比，抗菌蛋白清除羥自由基能力相對較弱，但是呈現(xiàn)出一定的線性關系。

圖10 不同濃度抗菌蛋白對羥自由基的清除作用

3 討論

利用食用菌液體發(fā)酵可以在較短時間獲得大量菌絲體及其發(fā)酵產物，其中包括多糖、肽類、蛋白、生物堿、萜類化合物、甾醇、酶等多種化合物及植物激素等多種生理活性物質，往往諸類生理活性物質含量高于子實體，在抗癌、消炎、抗衰老、抗菌和提高免疫力等方面有顯著功效［18-20］。食用菌液體發(fā)酵培養(yǎng)往往受溫度、pH、搖床振蕩頻率及接種量等因素影響，因此，液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化無疑一個關鍵步驟［21-22］。戴兵等［14］設置搖床溫度為25℃，轉速為160 r/min，培養(yǎng)時間為7 d，得到香菇菌絲發(fā)酵液，經過濾、硫酸銨沉淀得到香菇菌絲發(fā)酵液蛋白。香菇C91-3菌絲發(fā)酵液已被證實具有明顯的體外抗腫瘤、抗細菌作用［23］；張中林等［24］對真菌菌絲發(fā)酵液抗氧化活性檢測，SOD酶活性為雞腿菇＞金針菇，GSH-Px酶活性為雞腿菇＞香菇＞金針菇，結果表明菌絲發(fā)酵液均有較強的抗氧化能力。陸武祥等［25］通過5種食用菌液體發(fā)酵菌絲得到蛋白和多糖，進行含量測定及各發(fā)酵液蛋白的抗氧化活性測定，其中，雞腿菇有較強的抗氧化能力，隨著蛋白含量的增高，抗氧化活性越強。本研究發(fā)現(xiàn)雞腿菇菌絲發(fā)酵液抗菌蛋白對羥自由基清除率隨著其質量濃度的增加而增加，這與學者張中林研究一致。有關該菌株所產抗菌蛋白的進一步精細純化和基因表達等相關研究還待深入。

4 結論

在單因素試驗的基礎上，將響應面分析法應用于雞腿菇液體發(fā)酵產抗菌蛋白的研究，實驗結果表明，發(fā)酵時間、搖床轉速及接種量是影響抗菌蛋白產量的主要因素。最佳條件為：時間5 d、溫度30℃、pH7、接種量5%、搖床轉速100 r/min，在此條件下抗菌蛋白的抑菌圈直徑達21.14 mm。同時，測定了雞腿菇菌絲發(fā)酵液抗菌蛋白的抗氧化能力，對DPPH、ABTS自由基的清除能力相對較弱，而對羥基自由基（·OH）有較強的清除作用，其抗氧化能力隨著抗菌蛋白質量濃度的增加而增強。

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