張文婷，李婕，陳健

（海南大學食品學院，海南?？?70228）

近年來，羅非魚因其肉質(zhì)鮮美細嫩，逐漸替代傳統(tǒng)白肉魚，日漸受到歐美市場的青睞，尤其是羅非魚冷凍魚糜[1-2]。但是魚糜中的蛋白質(zhì)在冷凍和冷藏的過程中，容易發(fā)生冷凍變性，嚴重影響產(chǎn)品品質(zhì)[3-4]。向魚糜蛋白制品加入抗凍劑可以有效防止魚糜蛋白的變性，目前常用卵磷脂、蔗糖和磷酸鹽等作為抗凍保護劑。卵磷脂和蔗糖因甜度和熱量高，影響了魚糜及其制品的口味和健康營養(yǎng)價值[5-6]。磷酸鹽尤其是三聚磷酸鹽對多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護作用，添加在食品中能有效防止蛋白質(zhì)變性、淀粉老化，抑制臭味、腐腥味的產(chǎn)生[7-9]。

三聚磷酸鹽為白色結(jié)晶粉末，在水中極易溶解，黏著性很強，1%水溶液的pH值為9.5[10]。添加少量三聚磷酸鹽，就能對肉制品起到很好護色、預(yù)防變質(zhì)和分散的功效，還能增強脂肪的乳化性。添加三聚磷酸鈉的肉制品，水分在高溫加熱后流失少，成品完整度較好、色澤無差異、肉質(zhì)柔嫩，容易切片，切面有光澤，是應(yīng)用最多的一種磷酸鹽，最大使用量為1%。三聚磷酸鹽還具有安全、無毒、易降解的性質(zhì)，因此三聚磷酸鹽可以作為優(yōu)良的抗冷凍變性劑在食品工業(yè)中大量應(yīng)用[11-12]。為了抑制冰晶的增長速率和形態(tài)學不穩(wěn)定性，Enjakul等[13]通過原位觀察的實驗方法證明了三聚磷酸鹽比蔗糖的效果更好。Kingduean等研究證實鯔魚中Ca2+-ATP酶的活性只需0.5%的三聚磷酸鹽即可完全抑制，并且最大限度的保持水分不凍結(jié)[14]。郭穎等在魷魚魚糜中加入3種磷酸鹽，發(fā)現(xiàn)焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉和三聚磷酸鈉添加量各為0.30%時，魚糜的硬度、彈性達到最大[15]，由此證明了磷酸鹽的優(yōu)良特性。

三聚磷酸鹽具有保護蛋白質(zhì)分子的天然結(jié)構(gòu)，保持食品風味和質(zhì)地的效果[10]。同時，三聚磷酸鹽作為抗凍劑，可以避免添加甜度較高的抗凍劑例如蔗糖、山梨醇等使魚糜的甜度增加，從而影響產(chǎn)品風味[16]。本試驗著重探討三聚磷酸鹽對冷凍羅非魚魚糜中蛋白質(zhì)的保護作用，為將三聚磷酸鹽作為冷凍魚糜的抗凍保護劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚（每條魚約500 g）：海口市沿江三東路農(nóng)貿(mào)市場。

三聚磷酸鹽（純度≥99%）、磷酸鹽緩沖溶液：北京索萊寶科技有限公司；Weber-Edsall溶液、雙縮脲試劑：廣州化學試劑廠；Tris-maleate溶液：南京森貝伽生物科技有限公司；ATP酶檢測試劑盒：南寧中諾生物工程有限責任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎機（DS-1）：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；多管架自動平衡離心機（TDZ5-WS）：上海安亭科學儀器廠；紫外分光光度計（UV1700型）：日本島津公司；冰箱（BD-80）：青島海爾電冰箱股份有限公司；電子天平（SHIMADZU AUW220）：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜制作流程

活羅非魚→前處理（去鱗）→流水洗凈→采肉→漂洗→脫水→打漿→添加三聚磷酸鹽（添加量依次為0%、0.1%、0.3%、0.6%）→混勻→密封→-18℃凍藏

1.3.2 鹽溶性蛋白含量的測定

準確稱取一定質(zhì)量并充分研碎成為魚糜制品的羅非魚，加入10倍體積（離子強度=0.05，pH=7.5）的磷酸鹽緩沖溶液，提取5 min，在4 000 r/min下離心5 min，去上清液，重復(fù)上述步驟兩次，取離心后的沉淀魚糜加入10倍量的Weber-Edsall溶液（0.6 mol/L KCl-0.01 mol/L Na2CO3-0.04 mol/L NaHCO3），在 4℃下浸提20 h，4 000 r/min下離心7 min，測量上清液的體積，蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測定[17]。

1.3.3 制備肌原纖維蛋白溶液

準確稱取一定質(zhì)量的羅非魚魚糜制品，加入10倍體積pH=7.0，內(nèi)含0.05 mol/L KCl的20 mmol/LTrismaleate緩沖液，充分勻漿1 min，在6 000 r/min的條件下低溫離心10 min，洗去魚糜樣品中殘留水溶性蛋白質(zhì)。棄上清液，向沉淀魚糜中加入10倍體積的pH=7.0，內(nèi)含 0.6 mol/L KCl的 20 mmol/L Tris-maleate緩沖液，充分勻漿1 min后在4℃下浸提1 h，然后在6 000 r/min，4℃下離心10 min，上清液即為試驗用肌原纖維蛋白溶液[18]。

1.3.4 肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性測定

肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力利用ATP酶檢測試劑盒，在低離子強度下加入0.06 mol/L KCl、pH=7.0的25 mmol/LTris-maleate溶液測定。向0.2 mg/mL～0.4 mg/mL肌原纖維蛋白中加入1 mmol/L ATP和5 mmol/L CaCl2，混合物在25℃下反應(yīng)5 min，最后將0.5 mL高氯酸溶液（質(zhì)量分數(shù)15%）加入2 mL反應(yīng)液中來結(jié)束反應(yīng)。反應(yīng)中釋放的無機磷含量通常是采用鉬酸銨法來進行測定，Ca2+-ATP酶活力用25℃恒溫條件下，每分鐘1 mg蛋白質(zhì)所生成的無機磷的微摩爾數(shù)表示[19]。

式中：A為1 mL反應(yīng)液生成的磷酸量，μmol；B為空白值，μmol；t為反應(yīng)時間，min；酶蛋白質(zhì)量為 1 mL反應(yīng)液所含的酶量，mg。

1.3.5 自由液滴和加熱液滴損失

參考文獻[20]的方法，并稍微改動。

1.3.5.1 自由液滴測定

準確稱取一定質(zhì)量的羅非魚魚糜，立刻放入含有濾紙的培養(yǎng)皿中，密封在8℃～10℃恒溫箱培養(yǎng)2 h后取出，用濾紙拭去魚片表面的液體，立即稱重，根據(jù)公式2計算自由液滴損失。

1.3.5.2 加熱液滴測定

準確稱取一定質(zhì)量的羅非魚魚糜，放入具有蓋子的鋁質(zhì)小盒內(nèi)，用沸水蒸蓋緊的鋁制小盒10 min，取出后將試樣放入帶銅網(wǎng)的離心管，2 500 r/min下離心10 min后稱取魚糜重量，根據(jù)公式3計算加熱液滴損失。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚糜凍藏過程中鹽溶性蛋白含量的變化

羅非魚魚糜分別用4組不同濃度的三聚磷酸鹽處理，并在-18℃條件下冷藏8周，每周觀察一次鹽溶性蛋白的含量變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 羅非魚魚糜鹽溶性蛋白在凍藏過程中含量變化Fig.1 The change of salt-soluble protein content in tilapia surimi during frozen storage

經(jīng)過三聚磷酸鹽處理過魚糜的鹽溶蛋白含量下降率明顯低于對照組（0%三聚磷酸鹽）（P＜0.05）。在對照組中，從開始的第1周到第4周期間，鹽溶蛋白含量由84.12%下降到54.27%，下降率達到35.49%，而對于分別添加質(zhì)量分數(shù)為0.1%、0.3%和0.6%三聚磷酸鹽處理后的試驗組，下降率分別是32.20%、14.12%和12.13%。由此可說明，鹽溶蛋白的含量在前4周都呈快速下降趨勢，但添加三聚磷酸鹽的各組下降率比對照組低，并呈濃度依賴關(guān)系。在第4周到第8周期間，各組中的鹽溶性蛋白含量均平緩下降。對照組的鹽溶性蛋白含量在第8周已經(jīng)下降到原來的52.32%，而質(zhì)量分數(shù)分別為0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸鹽試驗組下降率分別是46.58%、30.16%和27.98%。圖1結(jié)果表明三聚磷酸鹽具有降低魚糜制品在凍藏過程中鹽溶性蛋白的損失，對蛋白質(zhì)有顯著的冷凍保護作用。從圖1中還可看出，0.1%三聚磷酸鹽效果要顯著低于0.3%和0.6%，同時0.3%和0.6%三聚磷酸鹽對鹽溶性蛋白的溶出量相差僅為2.18%，因此從降低生產(chǎn)成本方面考慮，冷凍前的羅非魚魚糜采用0.3%三聚磷酸鹽處理。

冷凍魚糜的主要成分是肌原纖維蛋白質(zhì)，但在凍藏過程中，肌原纖維蛋白發(fā)生化學反應(yīng)，生成氫鍵、二硫鍵、疏水鍵和鹽鍵，它們相互反應(yīng)而產(chǎn)生聚集變性，導(dǎo)致鹽溶性下降，從而使魚糜制品的蛋白變性，產(chǎn)品出現(xiàn)問題[21-22]。三聚磷酸鹽之所以能提高蛋白質(zhì)的抗凍性，可能是由于蛋白質(zhì)分子中的某些基團可以與三聚磷酸鹽中的羥基發(fā)生反應(yīng)，減少了蛋白質(zhì)分子之間因官能團發(fā)生反應(yīng)而產(chǎn)生的聚集變性[6]。另外三聚磷酸鹽具有高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度，可減少冰晶體形成量，減緩蛋白質(zhì)分子的相互聚集，間接地對蛋白質(zhì)起保護作用[8]。

2.2 凍藏過程中魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性變化

衡量魚糜在冷凍貯藏過程中蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個重要指標是Ca2+-ATP酶活性，活性值越高，表明魚糜蛋白質(zhì)性質(zhì)越穩(wěn)定，冷凍變性程度越小，品質(zhì)也越好[23-24]。凍藏過程中魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性變化見圖2。

圖2 羅非魚魚糜肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活性在凍藏過程中含量變化Fig.2 The change of Ca2+-ATP activity in myofibrillar protein of tilapia surimi during frozen storage

由圖2可知，羅非魚魚糜在-18℃凍藏30 d后，所有組魚糜中的肌原纖維蛋白Ca2+-ATP酶活力均呈下降趨勢。對照組（0%三聚磷酸鹽）中該酶活力在凍藏前為0.82 μmol/（mg·min），而凍藏后只有0.23 μmol/（mg·min），下降率高達71.95%；而0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸鹽組，其肌原纖維蛋白中Ca2+-ATP酶活性分別由最開始的0.84、0.89、0.91 μmol/（mg·min）下降到0.29、0.42、0.47 μmol/（mg·min），下降率分別為65.48%、52.80%和48.35%。試驗結(jié)果表明，三聚磷酸鹽的加入能減少肌原纖維中Ca2+-ATP酶活性的下降。同時發(fā)現(xiàn)，分別經(jīng)0.3%和0.6%三聚磷酸鹽溶液浸漬處理的試驗組對Ca2+-ATP酶活性影響差別不大。因此，考慮成本因素，選擇0.3%三聚磷酸鹽浸泡羅非魚魚糜后再冷凍，可使魚糜蛋白質(zhì)冷凍變性程度小。

2.3 凍藏過程中魚糜液滴損失

凍藏過程中魚糜液滴損失見圖3、圖4。由圖3所示，不同濃度三聚磷酸鹽溶液處理后的凍藏羅非魚魚糜，隨著凍藏時間的增加自由液滴的損失，均明顯低于對照組，持水能力得到大的改善。凍藏30 d后，對照組（0%三聚磷酸鹽）自由液滴損失為3.19%，而0.1%、0.3%和0.6%三聚磷酸鹽組的液滴損失分別為3.04%、1.21%和1.15%。繼續(xù)凍藏到60 d后，添加三聚磷酸鹽的3個組中自由液滴損失分別為對照組的81.41%、36.91%和35.60%。

由圖4結(jié)果可知，羅非魚魚糜先經(jīng)過三聚磷酸鹽溶液處理再冷凍，在凍藏過程中加熱液滴損失均小于對照組（0%三聚磷酸鹽）。凍藏60 d后質(zhì)量分數(shù)分別為0.1%、0.3%和0.6%的三聚磷酸鹽組的加熱液滴損失分別為38.57%、31.14%和32.02%，只有對照組的93.53%、75.51%和77.64%。由上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在羅非魚魚糜凍藏過程中，加入三聚磷酸鹽能有效的減少魚糜的液滴損失。

圖3 羅非魚魚糜在凍藏過程中的自由液滴損失Fig.3 The change of free droplets loss in tilapia surimi during frozen storage

圖4 羅非魚魚糜在凍藏過程中的加熱液滴損失Fig.4 The change of heating droplets loss in tilapia surimi during frozen storage

3 結(jié)論

羅非魚魚糜用0.3%三聚磷酸鹽處理后，鹽溶性蛋白損失明顯減少，肌原纖維蛋白中Ca2+-ATP酶活性的下降率較低，并能減輕魚糜的液滴損失，對羅非魚魚糜蛋白質(zhì)的冷凍變性有明顯的保護作用，可作為魚類蛋白質(zhì)冷凍保護物質(zhì)。

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