錢志宏 倪悅 葛丹亙

心房顫動(dòng)(簡(jiǎn)稱房顫)患者血清C反應(yīng)蛋白(CRP)濃度明顯增高[1-2]，CRP 作為一種非特異性的炎癥反應(yīng)指標(biāo), 在房顫發(fā)病中有一定的指導(dǎo)價(jià)值。CRP通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，能與血管內(nèi)膜中的脂蛋白結(jié)合后，產(chǎn)生大量終末攻擊復(fù)合物，可氧化損傷心肌細(xì)胞和心房細(xì)胞，并且引起心房的結(jié)構(gòu)改變[3]，心肌發(fā)生纖維化改變，心電傳導(dǎo)功能發(fā)生異常，引起房顫的發(fā)生。CRP血清濃度越高，房顫發(fā)作可能性越大。

血清中CRP 是由外界環(huán)境因素與本身遺傳因素相互作用后的結(jié)果。Miller 等[4]通過(guò)基因組學(xué)研究表明CRP 基因變異對(duì)血清CRP 水平有35%～50% 的作用，而CRP基因1441C/T位于3′非翻譯區(qū)，能明顯影響基礎(chǔ)水平CRP分泌，并且在炎癥刺激下能升高 CRP濃度水平[5]。那么CRP多態(tài)性與房顫發(fā)病到底有無(wú)相關(guān)性呢？目前在國(guó)內(nèi)外缺少這兩者之間關(guān)系的研究。筆者就CRP1441C/T多態(tài)性與孤立性房顫(LAF)的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及與血清CRP濃度之間三者之間的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

本研究所有入選對(duì)象為蘇南地區(qū)的漢族人群，均為本院門診及住院患者，從2010年6月到2016年6月收集 LAF患者共116例，入組前均未行射頻消融術(shù)，行超聲心動(dòng)圖左房直徑小于50 mm[(45.22±3.25)mm]，其中陣發(fā)性房顫54例，均為入組前30天內(nèi)有發(fā)作，且有明確的心電圖支持；持續(xù)性房顫62例。LAF入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡小于60歲，未發(fā)現(xiàn)有明確病因和任何器質(zhì)性心臟病。其中男72例，女44例，年齡(52.82±3.85)歲作為病例組。選擇同期正常體檢112例，排除糖尿病和高血壓者，并詢問(wèn)病史未有過(guò)陣發(fā)性心悸者(男70例，女42例)，年齡(51.10±4.68)歲作為對(duì)照組。所有入選對(duì)象排除嚴(yán)重肝、腎功能異常及甲狀腺功能亢進(jìn)患者；并排除慢性炎癥性疾病(兩組中性粒細(xì)胞數(shù)及血沉無(wú)異常)。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)討論通過(guò)，所有入選對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1CRP基因1441C/T檢測(cè) 采用相應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，上游引物為5′CCCTTCAGTCCTAATGTCC 3′，下游引物為5′GCTCTTGCCTTATGAGTTTT3′。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系為30 μl，包括：2X GoTaq Green Master Mix 15 μl，模板DNA 0.5 μl，10 μmol/L上下游引物各0.75 μl，Nuclease-FreeWater 13ul ，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，然后按95℃ 30 s，52℃ 30 s， 72℃30 s進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μl，限制性內(nèi)切酶Hpych4III( NEB公司)酶切電泳，具體檢測(cè)方法參照本實(shí)驗(yàn)室既往研究[6]。

1.2.2CRP濃度測(cè)定 病例組患者入院時(shí)，對(duì)照組體檢時(shí)抽取外周靜脈血2 ml，置入EDTA抗凝管，靜置2 h后，3 000 r/min，離心10 min，收集上層血清，放于-70℃冰柜保存待測(cè)。CRP濃度測(cè)定，采用ELISA試劑盒。ELISA試劑盒為人-hsCRP試劑盒；廠家：廈門慧嘉生物，貨號(hào)：EHJ-10173 h；檢測(cè)范圍：100～2 000 ug/L；變異范圍：批內(nèi)9% 、批間：11%，每個(gè)樣本測(cè)1次，正常人群血清CRP中位數(shù)范圍：0.58～1.13 mg/L。并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，讀取光密度值，并計(jì)算其相應(yīng)濃度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物酶切結(jié)果

CRP1441C/T位點(diǎn)特異引物 PCR擴(kuò)增得到 460 bp的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶 HpyCH4Ⅲ酶切后，由于HpyCH4Ⅲ可切割C基因型為311、149bp兩個(gè)片段，故可產(chǎn)生 3種基因型片段：野生型純合子 (CC)帶型為 311、149bp兩條條帶，雜合子(CT)帶型為 460、311和149bp 三條條帶，突變純合子(TT)帶型為 460bp一條條帶(圖1)。

2.2CRP基因型和等位基因頻率分布

病例組和對(duì)照組 CRP1441C/T基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡；兩組間CC、CT基因型頻率分布無(wú)差異(P=0．375)，僅在病例組發(fā)現(xiàn)一個(gè)TT基因型；等位基因頻率分布：兩組含T等位基因頻率也無(wú)差異(P=0．220)。見表 1。

表1 基因型與LAF關(guān)系

2.3兩組血清CRP水平

病例組血清CRP水平明顯高于對(duì)照組，亞組間比較：CC、CT+TT基因型病例組血清濃度明顯高于對(duì)照組；組內(nèi)比較時(shí)，亞組間CT+TT與CC基因型濃度無(wú)差異。見表2。

表2 血清CRP濃度比較 /(mg/L)

3 討論

房顫是臨床常見的快速型心律失常，其發(fā)生卒中風(fēng)險(xiǎn)是正常人群4～6倍，死亡風(fēng)險(xiǎn)是正常人群1～2倍，目前已知是一種炎癥反應(yīng)，炎癥在房顫的發(fā)生和維持中起著重要作用[7]。

人類CRP有206個(gè)氨基酸殘基組成，編碼CRP基因長(zhǎng)約2250bp，有2個(gè)外顯子中間被一個(gè)內(nèi)含子分開，基因位于1號(hào)染色體長(zhǎng)臂上[3]。Pankow 等[8]研究報(bào)道，遺傳因素對(duì)血清 CRP 水平所起的作用可達(dá) 35%～ 40%。CRP1441C/T 位于轉(zhuǎn)錄區(qū)，為功能性多態(tài)性位點(diǎn)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄機(jī)制可影響血清中CRP濃度水平。但是，關(guān)于CRP1441C/T多態(tài)性對(duì)血清影響，目前國(guó)內(nèi)外此方面報(bào)道結(jié)論有部分差異。在國(guó)外的研究中，Shakhnovich 等[9]研究認(rèn)為CRP1441C/T多態(tài)性TT純合子比C等位基因攜帶的血清CRP水平高；而Pai等[10]對(duì)1003例急性心肌梗死患者測(cè)試CRP濃度，未發(fā)現(xiàn)CRP1441C/T 多態(tài)性和血清 CRP 水平間有相關(guān)性。國(guó)內(nèi)朱名安等[11]檢測(cè)250例健康體檢者后，發(fā)現(xiàn)CRP1441C/T位點(diǎn)有T T 、CT 、CC3種不同基因型，在檢測(cè)CRP濃度后，發(fā)現(xiàn)攜帶TT基因型血清 CRP濃度明顯高于CC基因型；而Yan等[12]檢測(cè)128例冠心病患者和119例健康人群，卻只發(fā)現(xiàn)CT、CC兩種基因型，并且發(fā)現(xiàn)攜帶CC基因型的血清濃度高與CT基因型，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而楊海濤等[13]檢測(cè)221例冠心病患者和161例健康人群，也僅僅發(fā)現(xiàn)CT、CC兩種基因型，攜帶CT基因型的血清濃度高與CC基因型，兩者也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

從本研究中可以看出，在檢測(cè)CRP濃度水平后，病例組CRP血清水平明顯大于對(duì)照組，且在兩組亞組中也得到了證實(shí)，說(shuō)明血清 CRP濃度與LAF發(fā)病有相關(guān)性，CRP濃度越高越易發(fā)作LAF；組內(nèi)比較時(shí)，亞組間LAF組與對(duì)照組CT+TT基因型血清濃度高于CC基因型血清濃度，但兩者血清 CRP水平無(wú)統(tǒng)計(jì)差異，說(shuō)明CRP1441C/T 多態(tài)性可能與CRP濃度有關(guān)；本研究檢測(cè)CRP1441C/T單核苷酸多態(tài)性后，比較兩組間基因型頻率分布及等位基因頻率分布，未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但病例組CT基因型及含T等位基因多于對(duì)照組，且僅在病例組中發(fā)現(xiàn)TT一種基因型，說(shuō)明CRP1441C/T 多態(tài)性可能與LAF有關(guān)；含有T等位基因的個(gè)體CRP血清濃度較高，這些與國(guó)內(nèi)Yan等[12]，楊海濤等[13]研究相一致，猜測(cè)可能由于發(fā)生T等位基因突變后，通過(guò)轉(zhuǎn)錄機(jī)制促進(jìn)血清CRP水平分泌，引起CRP濃度增高，誘發(fā)LAF的發(fā)生。T突變等位基因可能會(huì)提高血清濃度，而C等位基因可能是一個(gè)保護(hù)因子。

本課題與國(guó)外研究存有差異，考慮與種族及地區(qū)人群環(huán)境差異有關(guān)。另外，本研究也存在一些缺陷：入選的研究對(duì)象量不大，所選的對(duì)照組只是正常健康體檢者，可能會(huì)有部分房顫患者。CRP1441C/T多態(tài)性與LAF的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及與血清CRP濃度之間三者之間的確切關(guān)系尚需擴(kuò)大樣本量，聯(lián)合多中心多地區(qū)人群做進(jìn)一步研究。

1 Li JY, He Y, Ke HH, et al.Plasma oxidative stress and inflammatory biomarkers are associated with the sizes of the left atrium and pulmonary vein in atrial fibrillation patients[J].Clinical Cardiology, 2017,40(2):89

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