張艷麗,吐爾遜·沙比爾
外傷性癲癇(Posttraumatic epilepsy,PTE)是繼發(fā)于創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)后的發(fā)作性功能異常。PTE是腦外傷的常見后遺癥,在TBI患者中有著較高的發(fā)病率和死亡率[1],同時(shí)也是臨床上難治性癲癇的常見原因。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,p-mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,具有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng),越來(lái)越多的證據(jù)表明mTOR異常激活可誘導(dǎo)PTE的發(fā)生,并在TBI患者及PTE動(dòng)物模型中mTOR通過(guò)磷酸化被激活,活化的mTOR可通過(guò)磷酸化下游多種效應(yīng)分子產(chǎn)生多重病理生理改變從而引起癲癇的進(jìn)一步發(fā)展[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)人與鼠的mTOR序列一致性高達(dá)98%[3]。目前在其他病因引起的癲癇中發(fā)現(xiàn)mTOR通路的異常激活,但mTOR信號(hào)通路在PTE中的激活情況及與PTE的關(guān)系目前還不明確[4-5]。目前PTE的動(dòng)物模型有鐵離子模型、液壓打擊模型、自由落體模型、控制性皮質(zhì)撞擊模型等,由于鐵離子模型接近人類腦外傷后出血的病理及臨床改變,成功率高,便于觀察及干預(yù)性的研究,同時(shí)額葉皮質(zhì)定位操作簡(jiǎn)單,故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)常用的右額葉注射FeCl2法建立PTE大鼠模型[6],觀察額葉皮質(zhì)mTOR通路相關(guān)蛋白p-mTOR(Ser2448)的動(dòng)態(tài)表達(dá),探討其在PTE中的發(fā)病作用,為PTE的防治提供理論基礎(chǔ)。
1.1 研究對(duì)象 健康成年雄性SD大鼠78只,體質(zhì)量180~220g,分為正常對(duì)照組(A組,n=6),生理鹽水對(duì)照組(B組,n=36)和癲癇模型組(C組,n=36)。
1.2 方法 ①PTE模型的制作:大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉,術(shù)區(qū)備皮后固定于大鼠立體定向儀頭架上,消毒,暴露顱骨,生理鹽水組和癲癇模型組大鼠右額葉皮質(zhì)的鉆孔坐標(biāo)為:前囟前2.0mm,中線旁3.0mm,硬膜下2.0mm,然后微量進(jìn)樣器緩慢進(jìn)針至靶點(diǎn),分別向靶點(diǎn)緩慢注射10uL的生理鹽水或FeCl2(0.1mol/L)[6],F(xiàn)eCl2粉劑由武漢萊康生物提供。速率均為1μL/min,注射后留針5min。麻醉清醒后進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),根據(jù) Racine分級(jí)判斷模型是否成功,0級(jí):無(wú)任何癲癇發(fā)作;I級(jí):凝視發(fā)作;II級(jí):出現(xiàn)規(guī)律性點(diǎn)頭或濕狗樣抖動(dòng),伴有或不伴有面部抽動(dòng)記;III級(jí):一側(cè)前肢震顫 ;IV級(jí):站立、雙前肢震顫及持續(xù)性點(diǎn)頭;V級(jí):前肢震顫加重,失去平衡跌倒而出現(xiàn)全身性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作;VI級(jí):發(fā)作衰竭導(dǎo)致死亡,出現(xiàn) 4 級(jí)或以上發(fā)作行為為制模成功[7]。②動(dòng)物處理:分別于制模后1h、24h、1周、2周、4周,先分別從A、B、C組各取6只,腹腔麻醉(以100g/L水合氯醛300g/kg腹腔麻醉)后,夾閉腹主動(dòng)脈脈和下腔靜脈,經(jīng)升主動(dòng)脈插管,灌注生理鹽水200ml,再灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.4,4℃)300ml,緩慢灌注至肢體完全僵硬、斷頭完整取腦,矢狀切片,福爾馬林固定,石蠟包埋,石蠟包埋后切片厚3μm。 二甲苯脫蠟3次,每次2min,然后切片常規(guī)脫蠟、水化(環(huán)保透明脫蠟液30min→無(wú)水乙醇5s→95%乙醇10s→80%乙醇5s→自來(lái)水水洗3min→蒸餾水3min)。
1.3 檢測(cè)指標(biāo) ①HE染色:將水化后的切片放入蘇木精染色1~2min,蒸餾水沖洗數(shù)秒,1%鹽酸酒精(70%酒精99ml+濃鹽酸1ml)沖洗10~30s,1%氨水酒精(70%酒精99ml+濃氨水1ml)沖洗數(shù)秒至30s不等,蒸餾水沖洗3min后使用伊紅染色40s,最后蒸餾水沖洗至無(wú)色。②免疫組化染色:組織切片后60℃烘片10h后二甲苯脫蠟2次,梯度乙醇脫水,蒸餾水沖洗凈,PBS漂洗;將玻片浸入3%過(guò)氧化氫溶液中,PBS漂洗;滴加一抗,兔抗人p-mTOR(Ser2448)單克隆抗體由美國(guó)Cell Signaling Technology公司提供,4℃孵育過(guò)夜,室溫中放置后PBS漂洗,滴加聚合物輔助劑,室溫孵育,PBS液漂洗;滴加二抗,抗兔通用型免疫組化試劑盒,購(gòu)于丹麥Dako公司。室溫孵育,PBS漂洗;滴加DAB溶液顯色,蒸餾水終止反應(yīng),棕黃色為染色陽(yáng)性;蘇木素復(fù)染后自來(lái)水沖洗,依次置于梯度乙醇脫水、二甲苯透明;中性樹膠封片,觀察結(jié)果。半定量分析p-mTOR(Ser2448)在額葉中的平均光密度(Mean Optical Density,MOD)值。
2.1 HE染色結(jié)果 A組(圖1a、b):組織結(jié)構(gòu)清晰,額葉的皮層未見神經(jīng)元變性。B組(圖1c、d):額葉可見螺旋狀神經(jīng)元纖維,胞漿變性、細(xì)胞腫脹不明顯。C組(圖1e、f):額葉皮質(zhì)可見鏤空或網(wǎng)狀病灶,細(xì)胞層次紊亂,神經(jīng)元嚴(yán)重變性,細(xì)胞核固縮、深染,細(xì)胞核仁消失,膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生,可見噬神經(jīng)現(xiàn)象。
圖1 額葉皮層神經(jīng)元HE染色結(jié)果(×400)
圖1a、c、e中的方框代表低倍鏡下隨機(jī)選取的視野,圖1b、d、f分別為隨機(jī)視野的高倍鏡圖像,箭頭代表變性的神經(jīng)元細(xì)胞
2.2 免疫組化結(jié)果 免疫組化定位p-mTOR(Ser2448)在額葉中主要表達(dá)在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中(p-mTOR抗原與抗體結(jié)合后顯示為棕色),細(xì)胞核及細(xì)胞外未見表達(dá)。圖2顯示1周后 A組(圖a、b)額葉p-mTOR(Ser2448)表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色,神經(jīng)元胞質(zhì)呈淺棕色,提示弱陽(yáng)性表達(dá); B組(圖c、d)細(xì)胞染色程度較A組加深,p-mTOR(Ser2448)表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增加;C組(圖e、f)可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂,胞質(zhì)呈明顯的棕黃色,提示該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。C組和B組比較,1h表達(dá)開始升高(t=-1.435,P=0.182),但差異并不顯著,1周表達(dá)高峰(t=-4.073,P=0.002),2周降低(t=-2.614,P=0.026),4周時(shí)再次升高(t=-2.506,P=0.031),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05 ),見表1。
圖2額葉皮層神經(jīng)元免疫組化結(jié)果a 、c 、e(×200),b、 d 、f(×400)
圖2a、c、e中的方框代表低倍鏡下隨機(jī)選取的視野,圖2b、d、f分別為隨機(jī)視野的高倍鏡圖像,圖2d,f箭頭所指分別代表p-mTOR弱陽(yáng)性表達(dá)和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元
時(shí)間B組C組tP1h2.108±0.4002.318±0.498-1.4350.18224h2.427±0.4952.778±0.515-2.9690.0141周2.603±0.5723.133±0.466-4.0730.0022周2.247±0.4882.543±0.505-2.6140.0264周2.345±0.4182.672±0.533-2.5060.031
根據(jù)目前已有的研究結(jié)果,mTOR信號(hào)通路參與了細(xì)胞凋亡、吞噬、膠質(zhì)增生、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道、軸突芽生等癲癇多種分子水平、細(xì)胞水平的病理改變,上游信號(hào)通路PI3K/Akt磷酸化后可激活mTOR,mTOR是一種相對(duì)保守的非典型絲/蘇氨酸蛋白激酶,具有復(fù)雜的下游效應(yīng),其中與PTE的發(fā)生有著重要聯(lián)系的是p-mTOR C1介導(dǎo)的下游信號(hào)通路,包括核糖體S6通路和4EBP1通路,S6屬于AGC激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激,S6經(jīng)p-mTOR C1激活后,磷酸化的S6k再將S6磷酸化,這樣使得含嘧啶基序序列mRNA的翻譯功能增強(qiáng);4EBPl也是p-mTOR C1的另外一個(gè)靶點(diǎn),當(dāng)mTOR信號(hào)通路激活時(shí),4EBPl會(huì)因被p-mTOR C1磷酸化而失活,導(dǎo)致4EBPl從真核細(xì)胞翻譯因子4E(eIF-4E)釋放出來(lái),從而降低4EBPl對(duì)蛋白翻譯的抑制作用,最終導(dǎo)致額葉神經(jīng)元興奮性增高,異常細(xì)胞同步放電,最終導(dǎo)致癲癇的發(fā)生[8-9]。本課題組通過(guò)向大鼠右側(cè)額葉皮質(zhì)內(nèi)注射鐵離子制造PTE動(dòng)物模型,該研究中額葉p-mTOR染色MOD最大的細(xì)胞主要分布于顆粒細(xì)胞層的胞質(zhì),同時(shí)分子層及多形細(xì)胞層也可見散在陽(yáng)性細(xì)胞分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,p-mTOR在正常大鼠額葉少量表達(dá);本研究結(jié)果提示PTE動(dòng)物模型中存在p-mTOR的表達(dá)增高,這與2009年Codeluppi[10]在PTE患者反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)mTOR激活的結(jié)果相似,考慮可能是由于PTE引起的一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致額葉顆粒細(xì)胞進(jìn)一步反應(yīng)性增殖,以及氧化應(yīng)激后導(dǎo)致已經(jīng)成熟的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化[11],所以1周時(shí)MOD值最高;C組在2周時(shí),p-mTOR的表達(dá)下降并接近正常水平,與B組該時(shí)間的比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析原因可能與1周時(shí)產(chǎn)生的神經(jīng)前體細(xì)胞分化為比較成熟的膠質(zhì)細(xì)胞及損傷區(qū)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞壞死有關(guān),故表達(dá)下降,但Sha等[12]研究顯示p-mTOR的表達(dá)增高仍可持續(xù)到2周,原因可能與不同研究者采用不同的動(dòng)物模型有關(guān),具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。在本研究中C組4周組p-mTOR表達(dá)再次升高,可能與發(fā)作性的癲癇發(fā)作導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)引起額葉顆粒細(xì)胞進(jìn)一步反應(yīng)增殖等因素有關(guān)[13]。
通過(guò)在大鼠額葉注射FeCl2引起大鼠PTE,并在大鼠額葉齒狀回觀察到反應(yīng)性增殖的顆粒細(xì)胞,其增殖和分化可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致mTOR通路的異?;罨约鞍l(fā)作性癲癇的發(fā)生有關(guān)聯(lián),最終導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度增生,神經(jīng)元數(shù)量減少、功能異常,海馬結(jié)構(gòu)紊亂[14-16];同時(shí)在損傷灶周圍皮質(zhì)觀察到反應(yīng)性增生的錐體神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞,其增殖和分化也可能與FeCl2氧化應(yīng)激刺激導(dǎo)致mTOR通路的異?;罨嘘P(guān)聯(lián),導(dǎo)致皮質(zhì)結(jié)構(gòu)的紊亂,從來(lái)誘發(fā)癲癇發(fā)作[17-18],后期陣發(fā)性癲癇的刺激與mTOR通路的激活互為因果關(guān)系,相互促進(jìn)進(jìn)一步誘發(fā)慢性癲癇。同時(shí)我們觀察到mTOR信號(hào)通路的異常激活在1周時(shí)最高,2周時(shí)降低,4周時(shí)又再次升高,和PTE大鼠的平均增加癲癇發(fā)作次數(shù)改變趨勢(shì)相似,這種mTOR通路的異常激活可能是導(dǎo)致晚期PTE發(fā)作的重要證據(jù)[19-20]。然而,反應(yīng)性增生的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞與mTOR的異常激活還需進(jìn)一步的觀察,是否可以使用mTOR通路的抑制劑RPN抑制mTOR的異常表達(dá)來(lái)治療PTE還需進(jìn)一步研究。本研究雖然發(fā)現(xiàn)PTE的發(fā)病機(jī)制可能與mTOR信號(hào)通路上額葉區(qū)p-mTOR(Ser2448)的表達(dá)異常增加有關(guān),但并未涉及顳葉及海馬區(qū)相關(guān)蛋白的研究,故還需要進(jìn)一步深入探索。
【參考文獻(xiàn)】
單因素分析結(jié)果表明,導(dǎo)致結(jié)腸癌合并腸梗阻患者術(shù)后傷口感染顯著性相關(guān)的因素有體重指數(shù)、合并糖尿病、術(shù)前化療、手術(shù)時(shí)間、術(shù)前低蛋白、術(shù)后引流管放置時(shí)間等(P<0.05),見表3。
[1] Frey LC. Epidemiology of posttraumatic epilepsy: a critical review[J]. Epilepsia, 2003, 44(10): 11-17.
[2] Cho CH. Frontier of epilepsy research-mTOR signaling pathway[J]. Experimental & molecular medicine, 2011, 43(5): 231-274.
[3] G?del M, Hartleben B, Herbach N, et al. Role of mTOR in podocyte function and diabetic nephropathy in humans and mice[J]. The Journal of clinical investigation, 2011, 121(6): 2197-2209.
[4] Shima A, Nitta N, Suzuki F, et al. Activation of mTOR signaling pathway is secondary to neuronal excitability in a mouse model of mesio‐temporal lobe epilepsy[J]. European Journal of Neuroscience, 2015, 41(7): 976-988.
[5] Bockaert J, Marin P. mTOR in brain physiology and pathologies[J]. Physiological reviews, 2015, 95(4): 1157-1187.
[6] 林元相, 徐如祥, 姜曉丹,等. 皮層注射氯化亞鐵建立外傷性癲癇動(dòng)物模型[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 5(4):372-377.
[7] Lüttjohann A, Fabene PF, van Luijtelaar G. A revised Racine's scale for PTZ-induced seizures in rats[J]. Physiology & behavior, 2009, 98(5): 579-586.
[8] Tee AR, Sampson JR, Pal DK, et al. The role of mTOR signalling in neurogenesis, insights from tuberous sclerosis complex[C]//Seminars in cell & developmental biology. Academic Press, 2016, 52(1): 12-20.
[9] Pitk?nen A, Lukasiuk K. Mechanisms of epileptogenesis and potential treatment targets[J]. The Lancet Neurology, 2011, 10(2): 173-186.
[10] Codeluppi S, Svensson C I, Hefferan M P, et al. The Rheb-mTOR pathway is upregulated in reactive astrocytes of the injured spinal cord.[J]. Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience, 2009, 29(4):1093-1104.
[11] Althaus A L, Sagher O, Parent J M, et al. Intrinsic neurophysiological properties of hilar ectopic and normotopic dentate granule cells in human temporal lobe epilepsy and a rat model[J]. Journal of neurophysiology, 2015, 113(4): 1184-1194.
[12] Sha L Z, Xing X L, Zhang D, et al. Mapping the spatio-temporal pattern of the mammalian target of rapamycin (mTOR) activation in temporal lobe epilepsy.[J]. Plos One, 2012, 7(6):391-412.
[13] Romá-Mateo C, Aguado C, García-Giménez J L, et al. Oxidative stress, a new hallmark in the pathophysiology of Lafora progressive myoclonus epilepsy[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2015, 88 (1): 30-41.
[14] Ostendorf A P, Wong M. mTOR Inhibition in Epilepsy: Rationale and Clinical Perspectives[J]. CNS drugs, 2015, 29(2): 91-99.
[15] Binder D K, Steinh?user C. Functional changes in astroglial cells in epilepsy[J]. Glia, 2006, 54(5): 358-368.
[16] Lipton J O, Sahin M. The neurology of mTOR[J]. Neuron, 2014, 84(2): 275-291.
[17] Kharatishvili I, Pitk?nen A. Posttraumatic epilepsy[J]. Current opinion in neurology, 2010, 23(2): 183-188.
[18] Berdichevsky Y, Dryer A M, Saponjian Y, et al. PI3K-Akt signaling activates mTOR-mediated epileptogenesis in organotypic hippocampal culture model of post-traumatic epilepsy[J]. The Journal of Neuroscience, 2013, 33(21): 9056-9067.
[19] Russo E, Citraro R, Constanti A, et al. The mTOR signaling pathway in the brain: focus on epilepsy and epileptogenesis[J]. Molecular neurobiology, 2012, 46(3): 662-681.
[20] Meng X F, Yu J T, Song J H, et al. Role of the mTOR signaling pathway in epilepsy[J]. Journal of the neurological sciences, 2013, 332(1): 4-15.