張艷麗，吐爾遜·沙比爾

外傷性癲癇(Posttraumatic epilepsy，PTE)是繼發(fā)于創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)后的發(fā)作性功能異常。PTE是腦外傷的常見后遺癥，在TBI患者中有著較高的發(fā)病率和死亡率[1]，同時也是臨床上難治性癲癇的常見原因。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，p-mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，越來越多的證據(jù)表明mTOR異常激活可誘導(dǎo)PTE的發(fā)生,并在TBI患者及PTE動物模型中mTOR通過磷酸化被激活，活化的mTOR可通過磷酸化下游多種效應(yīng)分子產(chǎn)生多重病理生理改變從而引起癲癇的進(jìn)一步發(fā)展[2]。既往研究發(fā)現(xiàn)人與鼠的mTOR序列一致性高達(dá)98%[3]。目前在其他病因引起的癲癇中發(fā)現(xiàn)mTOR通路的異常激活，但mTOR信號通路在PTE中的激活情況及與PTE的關(guān)系目前還不明確[4-5]。目前PTE的動物模型有鐵離子模型、液壓打擊模型、自由落體模型、控制性皮質(zhì)撞擊模型等，由于鐵離子模型接近人類腦外傷后出血的病理及臨床改變，成功率高，便于觀察及干預(yù)性的研究，同時額葉皮質(zhì)定位操作簡單，故本實驗通過常用的右額葉注射FeCl2法建立PTE大鼠模型[6]，觀察額葉皮質(zhì)mTOR通路相關(guān)蛋白p-mTOR(Ser2448)的動態(tài)表達(dá)，探討其在PTE中的發(fā)病作用，為PTE的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 健康成年雄性SD大鼠78只，體質(zhì)量180～220g，分為正常對照組(A組，n=6)，生理鹽水對照組(B組，n=36)和癲癇模型組(C組，n=36)。

1.2 方法 ①PTE模型的制作：大鼠以10%水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，術(shù)區(qū)備皮后固定于大鼠立體定向儀頭架上，消毒，暴露顱骨，生理鹽水組和癲癇模型組大鼠右額葉皮質(zhì)的鉆孔坐標(biāo)為：前囟前2.0mm，中線旁3.0mm，硬膜下2.0mm，然后微量進(jìn)樣器緩慢進(jìn)針至靶點，分別向靶點緩慢注射10uL的生理鹽水或FeCl2(0.1mol/L)[6]，F(xiàn)eCl2粉劑由武漢萊康生物提供。速率均為1μL/min，注射后留針5min。麻醉清醒后進(jìn)行行為學(xué)檢測，根據(jù) Racine分級判斷模型是否成功，0級：無任何癲癇發(fā)作；I級：凝視發(fā)作；II級：出現(xiàn)規(guī)律性點頭或濕狗樣抖動，伴有或不伴有面部抽動記；III級：一側(cè)前肢震顫 ；IV級：站立、雙前肢震顫及持續(xù)性點頭；V級：前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現(xiàn)全身性強直-陣攣性發(fā)作；VI級：發(fā)作衰竭導(dǎo)致死亡，出現(xiàn) 4 級或以上發(fā)作行為為制模成功[7]。②動物處理：分別于制模后1h、24h、1周、2周、4周，先分別從A、B、C組各取6只，腹腔麻醉(以100g/L水合氯醛300g/kg腹腔麻醉)后，夾閉腹主動脈脈和下腔靜脈，經(jīng)升主動脈插管，灌注生理鹽水200ml，再灌注含4%多聚甲醛的0.1mol/L PBS(pH7.4,4℃)300ml，緩慢灌注至肢體完全僵硬、斷頭完整取腦，矢狀切片，福爾馬林固定，石蠟包埋，石蠟包埋后切片厚3μm。 二甲苯脫蠟3次，每次2min，然后切片常規(guī)脫蠟、水化(環(huán)保透明脫蠟液30min→無水乙醇5s→95%乙醇10s→80%乙醇5s→自來水水洗3min→蒸餾水3min)。

1.3 檢測指標(biāo) ①HE染色：將水化后的切片放入蘇木精染色1～2min，蒸餾水沖洗數(shù)秒，1%鹽酸酒精(70%酒精99ml+濃鹽酸1ml)沖洗10～30s，1%氨水酒精(70%酒精99ml+濃氨水1ml)沖洗數(shù)秒至30s不等，蒸餾水沖洗3min后使用伊紅染色40s，最后蒸餾水沖洗至無色。②免疫組化染色：組織切片后60℃烘片10h后二甲苯脫蠟2次，梯度乙醇脫水，蒸餾水沖洗凈，PBS漂洗；將玻片浸入3%過氧化氫溶液中，PBS漂洗；滴加一抗，兔抗人p-mTOR(Ser2448)單克隆抗體由美國Cell Signaling Technology公司提供，4℃孵育過夜，室溫中放置后PBS漂洗,滴加聚合物輔助劑，室溫孵育，PBS液漂洗；滴加二抗，抗兔通用型免疫組化試劑盒，購于丹麥Dako公司。室溫孵育，PBS漂洗；滴加DAB溶液顯色，蒸餾水終止反應(yīng)，棕黃色為染色陽性；蘇木素復(fù)染后自來水沖洗，依次置于梯度乙醇脫水、二甲苯透明；中性樹膠封片，觀察結(jié)果。半定量分析p-mTOR(Ser2448)在額葉中的平均光密度(Mean Optical Density，MOD)值。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 A組(圖1a、b)：組織結(jié)構(gòu)清晰，額葉的皮層未見神經(jīng)元變性。B組(圖1c、d)：額葉可見螺旋狀神經(jīng)元纖維，胞漿變性、細(xì)胞腫脹不明顯。C組(圖1e、f)：額葉皮質(zhì)可見鏤空或網(wǎng)狀病灶，細(xì)胞層次紊亂，神經(jīng)元嚴(yán)重變性，細(xì)胞核固縮、深染，細(xì)胞核仁消失，膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，可見噬神經(jīng)現(xiàn)象。

圖1 額葉皮層神經(jīng)元HE染色結(jié)果(×400)

圖1a、c、e中的方框代表低倍鏡下隨機選取的視野，圖1b、d、f分別為隨機視野的高倍鏡圖像，箭頭代表變性的神經(jīng)元細(xì)胞

2.2 免疫組化結(jié)果 免疫組化定位p-mTOR(Ser2448)在額葉中主要表達(dá)在神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中(p-mTOR抗原與抗體結(jié)合后顯示為棕色)，細(xì)胞核及細(xì)胞外未見表達(dá)。圖2顯示1周后 A組(圖a、b)額葉p-mTOR(Ser2448)表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色，神經(jīng)元胞質(zhì)呈淺棕色，提示弱陽性表達(dá)； B組(圖c、d)細(xì)胞染色程度較A組加深，p-mTOR(Ser2448)表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)增加；C組(圖e、f)可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，胞質(zhì)呈明顯的棕黃色，提示該蛋白在細(xì)胞質(zhì)中呈強陽性表達(dá)。C組和B組比較，1h表達(dá)開始升高(t=-1.435，P=0.182)，但差異并不顯著，1周表達(dá)高峰(t=-4.073，P=0.002)，2周降低(t=-2.614，P=0.026)，4周時再次升高(t=-2.506，P=0.031)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05 )，見表1。

圖2額葉皮層神經(jīng)元免疫組化結(jié)果a 、c 、e(×200)，b、 d 、f(×400)

圖2a、c、e中的方框代表低倍鏡下隨機選取的視野，圖2b、d、f分別為隨機視野的高倍鏡圖像，圖2d，f箭頭所指分別代表p-mTOR弱陽性表達(dá)和強陽性表達(dá)的神經(jīng)元

時間B組C組tP1h2.108±0.4002.318±0.498-1.4350.18224h2.427±0.4952.778±0.515-2.9690.0141周2.603±0.5723.133±0.466-4.0730.0022周2.247±0.4882.543±0.505-2.6140.0264周2.345±0.4182.672±0.533-2.5060.031

3 討論

根據(jù)目前已有的研究結(jié)果，mTOR信號通路參與了細(xì)胞凋亡、吞噬、膠質(zhì)增生、突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)受體、離子通道、軸突芽生等癲癇多種分子水平、細(xì)胞水平的病理改變，上游信號通路PI3K/Akt磷酸化后可激活mTOR，mTOR是一種相對保守的非典型絲/蘇氨酸蛋白激酶，具有復(fù)雜的下游效應(yīng)，其中與PTE的發(fā)生有著重要聯(lián)系的是p-mTOR C1介導(dǎo)的下游信號通路，包括核糖體S6通路和4EBP1通路，S6屬于AGC激酶家族的絲氨酸/蘇氨酸激，S6經(jīng)p-mTOR C1激活后，磷酸化的S6k再將S6磷酸化，這樣使得含嘧啶基序序列mRNA的翻譯功能增強；4EBPl也是p-mTOR C1的另外一個靶點，當(dāng)mTOR信號通路激活時，4EBPl會因被p-mTOR C1磷酸化而失活，導(dǎo)致4EBPl從真核細(xì)胞翻譯因子4E(eIF-4E)釋放出來，從而降低4EBPl對蛋白翻譯的抑制作用，最終導(dǎo)致額葉神經(jīng)元興奮性增高，異常細(xì)胞同步放電，最終導(dǎo)致癲癇的發(fā)生[8-9]。本課題組通過向大鼠右側(cè)額葉皮質(zhì)內(nèi)注射鐵離子制造PTE動物模型，該研究中額葉p-mTOR染色MOD最大的細(xì)胞主要分布于顆粒細(xì)胞層的胞質(zhì)，同時分子層及多形細(xì)胞層也可見散在陽性細(xì)胞分布。實驗結(jié)果顯示，p-mTOR在正常大鼠額葉少量表達(dá)；本研究結(jié)果提示PTE動物模型中存在p-mTOR的表達(dá)增高，這與2009年Codeluppi[10]在PTE患者反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)mTOR激活的結(jié)果相似，考慮可能是由于PTE引起的一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致額葉顆粒細(xì)胞進(jìn)一步反應(yīng)性增殖，以及氧化應(yīng)激后導(dǎo)致已經(jīng)成熟的神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化[11]，所以1周時MOD值最高；C組在2周時，p-mTOR的表達(dá)下降并接近正常水平，與B組該時間的比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，分析原因可能與1周時產(chǎn)生的神經(jīng)前體細(xì)胞分化為比較成熟的膠質(zhì)細(xì)胞及損傷區(qū)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞壞死有關(guān)，故表達(dá)下降，但Sha等[12]研究顯示p-mTOR的表達(dá)增高仍可持續(xù)到2周，原因可能與不同研究者采用不同的動物模型有關(guān)，具體機制還有待于進(jìn)一步深入研究。在本研究中C組4周組p-mTOR表達(dá)再次升高，可能與發(fā)作性的癲癇發(fā)作導(dǎo)致的應(yīng)激反應(yīng)引起額葉顆粒細(xì)胞進(jìn)一步反應(yīng)增殖等因素有關(guān)[13]。

通過在大鼠額葉注射FeCl2引起大鼠PTE，并在大鼠額葉齒狀回觀察到反應(yīng)性增殖的顆粒細(xì)胞，其增殖和分化可能與氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致mTOR通路的異?；罨约鞍l(fā)作性癲癇的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，最終導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過度增生，神經(jīng)元數(shù)量減少、功能異常，海馬結(jié)構(gòu)紊亂[14-16]；同時在損傷灶周圍皮質(zhì)觀察到反應(yīng)性增生的錐體神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，其增殖和分化也可能與FeCl2氧化應(yīng)激刺激導(dǎo)致mTOR通路的異?；罨嘘P(guān)聯(lián)，導(dǎo)致皮質(zhì)結(jié)構(gòu)的紊亂，從來誘發(fā)癲癇發(fā)作[17-18]，后期陣發(fā)性癲癇的刺激與mTOR通路的激活互為因果關(guān)系，相互促進(jìn)進(jìn)一步誘發(fā)慢性癲癇。同時我們觀察到mTOR信號通路的異常激活在1周時最高，2周時降低，4周時又再次升高，和PTE大鼠的平均增加癲癇發(fā)作次數(shù)改變趨勢相似，這種mTOR通路的異常激活可能是導(dǎo)致晚期PTE發(fā)作的重要證據(jù)[19-20]。然而，反應(yīng)性增生的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞與mTOR的異常激活還需進(jìn)一步的觀察，是否可以使用mTOR通路的抑制劑RPN抑制mTOR的異常表達(dá)來治療PTE還需進(jìn)一步研究。本研究雖然發(fā)現(xiàn)PTE的發(fā)病機制可能與mTOR信號通路上額葉區(qū)p-mTOR(Ser2448)的表達(dá)異常增加有關(guān)，但并未涉及顳葉及海馬區(qū)相關(guān)蛋白的研究，故還需要進(jìn)一步深入探索。

【參考文獻(xiàn)】

單因素分析結(jié)果表明，導(dǎo)致結(jié)腸癌合并腸梗阻患者術(shù)后傷口感染顯著性相關(guān)的因素有體重指數(shù)、合并糖尿病、術(shù)前化療、手術(shù)時間、術(shù)前低蛋白、術(shù)后引流管放置時間等(P<0.05)，見表3。

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