任有良， 劉道廣， 張 悅， 溫 恒， 喬成芳， 劉 萍*

(1.商洛學院化學工程與現(xiàn)代材料學院，陜西商洛 726000;2.陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室，陜西商洛 726000)

端粒DNA(GDNA)是富含G堿基的高度保守的重復核苷酸序列，在K+、Na+等陽離子以及一些藥物小分子的存在下，通過Hoogsteen氫鍵形成穩(wěn)定的G -四鏈體結(jié)構(gòu)[1-4]。研究表明，能夠誘導端粒DNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)的小分子化合物具有重大的抗腫瘤意義，而以G -四鏈體為抗腫瘤藥物作用靶點篩選配體的方法是目前研究的熱點。

尋找以端粒DNA為作用靶點，毒性低的抗腫瘤藥物引起了科研工作者的極大的興趣。目前人們采用紫外吸收光譜、熒光光譜、電化學、圓二色光譜、核磁共振波譜、X-射線衍射、表面等離子體共振等多種方法[5-10]，從不同角度來研究GDNA與小分子配體的相互作用。熒光光譜法具有操作簡單、靈敏度高、響應速度快，尤其是已經(jīng)被廣泛應用的基于構(gòu)型轉(zhuǎn)換的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)方法是研究GDNA與配體之間作用機理的一個重要方法。Simonsson和Sj?back研究小組[6]在單鏈GDNA的兩端分別標記熒光基團和猝滅基團，在一些金屬離子或者四鏈體配體的作用下，GDNA自身折疊形成G -四鏈體，引起熒光共振能量轉(zhuǎn)移導致熒光強度減低，可以通過熒光強度的變化來檢測G -四鏈體的形成。Jin等[11]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移，用納米金作為猝滅劑，5′標記熒光素(FAM)的人端粒DNA(F-GDNA)作為探針，設計了一端標記的、簡單快速地篩選G -四鏈體配體的方法。雖然GDNA與小分子配體的熒光分析方法有很多，但是這些方法大多需要熒光標記，操作復雜，儀器昂貴，成本較高。因此非常有必要建立一些簡單、快速并且能夠被廣泛應用的方法來篩選與G -四鏈體作用的配體。

中藥單體是天然化合物的提取物，研究發(fā)現(xiàn)一些中藥單體像槲皮素、蘆丁、白楊素、大豆苷元等黃酮類化合物[12-15]對腫瘤治療有一定的化學預防作用。本文以天然抗腫瘤中藥單體槲皮素作為研究對象，基于GDNA結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，構(gòu)建了一種無標記熒光方法考察GDNA與槲皮素的相互作用，根據(jù)N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)/GDNA體系中加入槲皮素前后熒光強度的變化，快速有效地篩選能夠誘導GDNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)的藥物，為抗腫瘤藥物的開發(fā)和研究以及腫瘤的臨床治療等提供重要的。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-4600型日立熒光分光光度計(日本，日立公司)；UV-1600PC型紫外-可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；pHS-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司)；TGL-18C離心機(上海安亭科學儀器廠)。

人端粒DNA(F-GDNA)：(5′-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGG-3′)，RDNA:(5′-GTTCATGCCGCCCATGCTCG-3′)由上海生物工程有限公司合成，用TE緩沖溶液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=7.2)配制成100 μmol/L的儲備液；槲皮素、蘆丁、大豆苷元、黃連素、木犀草素、山奈酚、苦參堿、綠原酸、黃連素、熊果酸等(上海金穗生物科技有限公司)均用無水乙醇溶解，用超純水配制成濃度為100 μmol/L的母液；NMM(北京百靈威科技有限公司)、EDTA、無水乙醇等所用試劑均為分析純。實驗緩沖體系為pH=7.2的10 mmol/L Tris-HCl；用水均為Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1熒光光譜法取100 μL 5 μmol/L NMM溶液于微量比色皿中，測量其熒光光譜。向NMM溶液中加入1 μL 100 μmol/L GDNA，混合均勻后放置15 min，測定其熒光強度(F0);然后向體系中加入2 μL濃度為100 μmol/L槲皮素溶液，混合均勻后放置30 min，測定其熒光強度(F)。

激發(fā)光源采用氙燈激發(fā)，激發(fā)波長λex為610 nm，發(fā)射波長λem為600～700 nm，激發(fā)與發(fā)射光狹縫均為10 nm，光電倍增管電壓950 V。

1.2.2紫外-可見吸光光譜法移取2 mL 8 μmol/L NMM溶液于1 cm為石英比色皿中，測量其紫外光譜。向NMM溶液中加入5 μmol/L GDNA，混合均勻后放置15 min，測量其紫外光譜，然后再分別加入濃度為2 μmol/L和10 μmol/L的槲皮素溶液，混合均勻后放置30 min，進行紫外檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

NMM是一種特殊的陰離子卟啉化合物，能夠與G -四鏈體特異性結(jié)合，而對單鏈、二鏈體、三鏈體都無特異性結(jié)合[16-17]。NMM游離狀態(tài)時，熒光強度微弱，但NMM與G -四鏈體結(jié)合后，熒光強度顯著增強[18-19]。NMM已經(jīng)廣泛應用于DNA[20]、核酸酶[18]和一些生物小分子檢測。本文基于NMM與G -四鏈體的特異性結(jié)合，通過考察槲皮素與NMM/GDNA 作用前后體系熒光強度的變化，實現(xiàn)篩選 G -四鏈體小分子配體的目的。實驗原理見圖1。

圖1 無標記篩選G -四鏈體小分子配體的實驗原理Fig.1 Schematic illustration of label-free screening small molecule ligands of G-quadruplex

2.2 實驗可行性分析

2.2.1熒光光譜為驗證方法的可行性，我們選取槲皮素作為研究對象，分別測量了NMM、NMM/GDNA、NMM/GDNA+槲皮素體系的熒光強度。結(jié)果如圖2所示，NMM溶液熒光強度很低，當與 GDNA結(jié)合后，NMM的熒光強度有所增加，可能是NMM的環(huán)境改變引起，加入槲皮素配體后，體系的熒光強度明顯增強?？赡苁情纹に卣T導GDNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)，NMM嵌入G -四鏈體結(jié)構(gòu)中后使體系熒光強度大大增強。

為驗證實驗體系熒光強度的增加是因為槲皮素與GDNA相互作用形成了G -四鏈體，選擇了一條對照鏈RDNA，這條鏈含有少量鳥嘌呤G堿基，在其它條件不變的情況下，將GDNA換成RDNA，研究不同濃度槲皮素對NMM/RDNA的熒光強度的影響。結(jié)果表明，不同濃度的槲皮素不能使NMM/RDNA體系熒光強度增加。只有在NMM/GDNA體系里加入槲皮素，熒光強度才有明顯的增加，這與實驗原理相符合，即槲皮素能夠誘導單鏈的端粒DNA折疊形成G -四鏈體，從而使體系的熒光強度大大增強。

為進一步驗證實驗原理，還考察了一種生物堿類小分子苦參堿(Matrine)與NMM/GDNA體系的作用，在其它條件不變的情況下，研究不同濃度苦參堿對NMM/GDNA的熒光強度的影響，實驗所取條件與槲皮素相同，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，在NMM/GDNA體系中加入2、4、6、8和10 μmol/L的苦參堿以后，體系的熒光強度幾乎沒有改變，說明苦參堿不能誘導GDNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，苦參堿也不能使體系熒光強度增加，只有在NMM/GDNA體系中加入槲皮素，才能使體系的熒光強度得到增強，進一步說明槲皮素能夠誘導GDNA形成G -四鏈體。

圖2 NMM/GDNA體系與槲皮素作用的熒光光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of NMM/GDNA+Quercetina:5 μmol/L NMM;b:5 μmol/L NMM+1 μmol/L GDNA;c:b+2 μmol/L Quercetin.

圖3 NMM/GDNA體系與苦參堿作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence emission spectra of NMM/GDNA+Matrinea:NMM;b:NMM/RDNA;c - g:2,4,6,8,10 μmol/L Matrine.

2.2.2紫外-可見吸收光譜實驗還采用紫外-可見吸光光譜法來考察槲皮素與GDNA之間的相互作用。實驗結(jié)果如圖4所示，可以看出在NMM/GDNA體系中加入槲皮素后體系的吸收光譜發(fā)生了減色現(xiàn)象，可能是配體與G -四鏈體的氫鍵對發(fā)生π電子堆積，配體嵌插到G -四鏈體結(jié)構(gòu)中，插入的配體π*空軌道與堿基的π電子軌道發(fā)生耦合，耦合后π*軌道因部分填充電子，使π-π*躍遷幾率減小，產(chǎn)生了減色效應[5]。吸收光譜變化越大減色效應越明顯，表明嵌入程度越強。實驗結(jié)果也說明了槲皮素能誘導GDNA形成了G -四鏈體結(jié)構(gòu)，并嵌插入G -四鏈體中從而引起減色效應。

圖4 不同濃度的槲皮素與GDNA/NMM體系的紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of GDNA/NMM with different concentrations of Quercetina:8 μmol/L NMM;b:5 μmol/L GDNA;c:2 μmol/L Quercetin;d:8 μmol/L NMM+5 μmol/L GDNA;e:d+2 μmol/L Quercetin;f:d+10 μmol/L Quercetin.

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1穩(wěn)定時間的選擇實驗考察了槲皮素與NMM/GDNA體系熒光強度隨時間的變化關(guān)系。5 μmol/L NMM+1 μmol/L GDNA，混勻放置15 min，向該體系中加入2 μmol/L槲皮素后，每隔5 min測量該體系的熒光強度。結(jié)果顯示隨著作用時間的增加，體系熒光強度逐漸增加，但到30 min時，熒光強度變化趨于穩(wěn)定，說明槲皮素與NMM/GDNA已經(jīng)充分作用，實驗選擇混合30 min后測定。

2.3.2NMM濃度的選擇NMM的濃度對傳感器的熒光信背比產(chǎn)生顯著的影響。為了優(yōu)化實驗條件，考察了不同濃度NMM對體系熒光強度變化的影響。結(jié)果可以看出隨著熒光染料的濃度逐漸增加，傳感器的熒光變化值逐漸增加，當濃度增加為5 μmol/L后，傳感器的熒光強度變化達到最大。若繼續(xù)增加的濃度，傳感器的背景信號也會增大，熒光強度變化反而減小，實驗選擇NMM的濃度為5 μmol/L。

2.4 槲皮素濃度變化對 NMM/GDNA體系熒光強度的影響

實驗考察了槲皮素濃度與NMM/GDNA體系熒光強度變化之間的關(guān)系。結(jié)果如圖5(A)、5(B)所示。從5(A)可以看出：隨著槲皮素濃度逐漸增加，體系的熒光強度也在增強，這說明槲皮素的增加使得越來越多的GDNA形成了G -四鏈體，使得體系的熒光強度增大，同時也說明槲皮素是一種能夠誘導GDNA形成G -四鏈體的小分子配體。圖5(B)表示不同濃度槲皮素與體系熒光強度變化的點線圖及線性關(guān)系。結(jié)果顯示槲皮素濃度在2～10 nmol/L時與體系熒光強度變化呈良好的線性，檢出限0.7 nmol/L，線性方程[(F-F0)/F0]=0.0473c+0.0157(c的單位為nmol/L)，R=0.9972。

圖5 (A)不同濃度槲皮素與GDNA/NMM體系作用熒光光譜;(B)槲皮素濃度與GDNA/NMM體系熒光強度變化的點線圖和校準曲線Fig.5 (A) Fluorescence emission spectra of GDNA/NMM in presence of Quercetin with different concentration;(B)Point plots of change rate of fluorescence intensity GDNA/NMM with the increasing of Quercetin concentration and the calibration plots for QuercetinNMM:5 μmol/L;GDNA:1 μmol/L;Quercetin:b-f:0,2,4,6,8,10,100,200,1 000 nmol/L.

2.5 誘導GDNA形成G -四鏈體的小分子配體篩選

應用本方法考察了黃酮類化合物、生物堿、蒽醌類化合物和有機酸(表1)等小分子化合物，這些小分子化合物是從中藥中提取出來的天然抗腫瘤藥物小分子。通過考察加入藥物前后NMM/GDNA體系熒光強度的變化來反映不同藥物對體系的影響，從而來識別G -四鏈體的配體。表中ΔF=F-F0，其中F和F0分別表示不存在和存在藥物的情況下NMM/GDNA體系的熒光強度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同實驗條件下黃酮類化合物都能使NMM/GDNA體系的熒光強度有一定程度的增加，而生物堿類、蒽醌類化合物(大黃素)及有機酸卻變化不大。說明黃酮類化合物能促使GDNA形成G -四鏈體，而生物堿類、蒽醌類和有機酸等化合物難以誘導GDNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)。

表1 加入不同藥物引起NMM/GDNA體系熒光強度變化

*The concentration of NMM,GDNA and ligands are 5 μmol/L,1 μmol/L and 2 μmol/L,respectively.

3 結(jié)論

本文以槲皮素為研究對象，熒光染料NMM為指示劑，利用其與G -四鏈體結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的特點，構(gòu)建了一種在均相溶液中篩選 G -四鏈體小分子配體的熒光新方法。研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物能促使GDNA形成G -四鏈體，而生物堿類和有機酸等化合物難以誘導GDNA形成G -四鏈體結(jié)構(gòu)。該方法不僅用于考察槲皮素與 GDNA 的作用，還可以用于篩選與 G -四鏈體作用的離子、蛋白質(zhì)、合成的藥物等小分子配體，對抗腫瘤藥物的開發(fā)和研究，腫瘤的臨床治療等有重要的理論和實際意義。

參考文獻：

[1] Blackburn E H,Szostak J W.Annual Review of Biochemistry,1984,53:163.

[2] Wag Y,Patl D J.Journal of Molecular Cell Biology,1993,4(234):1171.

[3] Ying L,Green J J,Li H,et al.Proceedings of the National Academy of Sciences,2003,100(25):14629.

[4] Guo L Q,Nie D D,Qiu C Y,et al.Biosensors and Bioelectronics,2012,1(35):123.

[5] Mei H Y,Barton J K.Journal of the American Chemical Society,1986,9(108):7414.

[6] Simonsson T,Sj?back R.Journal of Biological Chemistry,1999,24(274):17379.

[7] Balagurumoorthy P,Brahlnaehari S K,MohantyD,et al.Nucleic Acids Research,1992,15(20):4061.

[8] Redman James E.Methods,2007,4(43):302.

[9] Sun H X,Xiang J F,Tang Y L,et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,4(352):942.

[10] LIU P,CHEN F Y,XIONG Z D,et al.Journal of Analytical Science(劉萍,陳鳳英,熊澤東,等.分析科學學報),2015,31(6):851

[11] Jin Y,Li H Y,Bai J Y,Analytical Chemistry,2009,81(14):5709.

[12] Sun H X,Tang Y L,Xiang J F,et al.Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2006,13(16):3586.

[13] Sun H X,Xiang J F,Tang Y L,et al.Biochemical and Biophysical Research Communications,2007,4(352):942.

[14] Cushnie T P T,Lamb A J.Antimicrob Lamb,International Journal of Anti-Microbial Agents,2005,5(26):343.

[15] Spedding G,Ratty A,Middleton E.Antiviral Research,1989,2(12):99.

[16] Sayal A,Aydin A,Savaser A,et al.Toxicology Letters,2008,180:81.

[17] Guo L Q,Nie D N,Qiu C Y,et al.Biosensors and Bioelectronic,2011,1(35):123.

[18] Hu D,Huang Z Z,Pu F,et al.Chemistry A European Journal,2011,17(5):1635.

[19] Qin H,Ren J，Wang J,et al．Chemical Communications,2010，46(39):7385.

[20] Zhao C Q ,Wu L,Ren J S,et al.Chemical Communications,2011,47(19):5461.