王麗博， 蘇立強(qiáng), 韓超男, 呂艷榮

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

孔雀石綠(MG)能有效預(yù)防和治療由細(xì)菌、真菌和寄生蟲引起的魚病，并且價(jià)格低廉，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。但孔雀石綠具有高毒性、高殘留、高致癌、致突變等危害，被指定為水生生物禁用藥物。因此對(duì)孔雀石綠的靈敏準(zhǔn)確檢測(cè)十分重要[1 - 2]。目前孔雀石綠的檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫法等[3 - 5]。水產(chǎn)品組織基質(zhì)復(fù)雜，常采用固相萃取(SPE)技術(shù)進(jìn)行前處理，但現(xiàn)有固相萃取填料多為非特異性，處理效果不理想。分子印跡技術(shù)可制備對(duì)目標(biāo)分子具有特異識(shí)別性的分子印跡聚合物(MIPs)，將其做為吸附材料，能選擇性分離富集復(fù)雜樣品中痕量分析物，有效去除基質(zhì)干擾，進(jìn)而提高分析的準(zhǔn)確度和靈敏度[6 - 8]。

近幾年，制備孔雀石綠印跡材料用于檢測(cè)水產(chǎn)品的相關(guān)文獻(xiàn)已有報(bào)道。You等[9]制備孔雀石綠磁性印跡材料，結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)法對(duì)魚肉中孔雀石綠殘留進(jìn)行分析。張建清[10]等采用原位聚合法制備孔雀石綠印跡檢測(cè)板，結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析法對(duì)海參、扇貝和蜆子中的孔雀石綠進(jìn)行分離富集。沉淀聚合法制備MIPs，具有操作簡單，聚合物表面潔凈，吸附量高的優(yōu)點(diǎn)。本文以孔雀石綠為模板分子，采用沉淀聚合法制備MIPs。將制得吸附容量更高的聚合物作為分離介質(zhì)，自制固相萃取小柱，通過優(yōu)化淋洗、洗脫條件，建立分子印跡固相萃取-高效液相色譜法，對(duì)水產(chǎn)品孔雀石綠殘留進(jìn)行分析，獲得較好結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

P230型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司)。

孔雀石綠(MG)、隱性孔雀石綠(LMG)、結(jié)晶紫(CV)、隱性結(jié)晶紫(LCV)標(biāo)準(zhǔn)品(阿拉丁試劑有限公司)；正己烷、氯仿、丙酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EDMA)(分析純，東京化成工業(yè)株式會(huì)社)；偶氮二異丁腈(AIBN)(分析純，北京化工廠)；α-甲基丙烯酸(MAA)、乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、冰乙酸、乙酸銨，均為色譜純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

稱取1 mg MG標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得0.01 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后取1 mL MG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于1 000 mL容量瓶中，以乙腈定容，配成0.01 μg/mL MG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

1.2 MIPs的制備

取模板分子MG 0.1824 g (0.5 mmol)溶于40 mL甲醇/乙腈(1∶1，V/V)溶液中，加入功能單體MAA 0.95 mL(1.5 mmol)，室溫靜置12 h后，加入交聯(lián)劑EDMA 1.41 mL (12 mmol)，引發(fā)劑AIBN 30 mg，超聲溶解，通氮除氧15 min，密封。60 ℃水浴聚合24 h，抽濾，冷卻到室溫，干燥，得到聚合物。用甲醇-乙酸(9∶1，V/V) 為洗脫液進(jìn)行索氏提取，直到洗脫液無色，真空干燥，得到MIPs。不加入模板分子，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，制備非印跡聚合物NIPs。

1.3 分子印跡固相萃取(MISPE)柱的制備及萃取條件優(yōu)化

稱取100 mg MIPs粉末均勻填入聚丙烯固相萃取(SPE)小柱中，在SPE柱底部和聚合物上方加入聚乙烯篩板，輕輕敲打使其緊實(shí)。先用5 mL乙腈和5 mL去離子水平衡SPE柱，然后將配制好的MG標(biāo)準(zhǔn)溶液過柱，考察淋洗、洗脫液條件對(duì)MISPE 小柱保留性能的影響，洗脫液干燥，溶解在流動(dòng)相，HPLC法測(cè)定。

1.4 樣品預(yù)處理

魚，蝦，貝類去鱗，去殼，取肌肉部分，粉碎備用。稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-乙酸鹽緩沖溶液，1 000 r/min勻漿提取30 s振蕩2 min，加5 g 酸性Al2O3，400 r/min離心10 min，取上層清液于100 mL分液漏斗，殘?jiān)尤?0 mL乙腈-乙酸鹽緩沖溶液，3 mL 鹽酸羥胺溶液，5 mL 對(duì)-甲苯磺酸溶液，振蕩2 min，400 r/min離心10 min，合并提取液，400 r/min離心10 min，45 ℃ 旋蒸近干，備用。

將堿性氧化鋁柱安裝在固相萃取裝置上，用5 mL乙腈和5 mL去離子水活化。甲醇-乙酸溶液洗脫萃取柱，洗脫液過0.45 μm有機(jī)過濾膜，HPLC法測(cè)定。

MISPE柱依次用5 mL 乙腈和5 mL去離子水活化，在優(yōu)化條件下對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

1.5 HPLC條件

色譜柱:SinoChrom-BP ODS柱(200×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:乙腈-乙酸銨緩沖溶液(pH=4.5)(80∶20,V/V)，使用前經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾裝置脫氣；紫外檢測(cè)波長為618 nm，進(jìn)樣量為15 μL，流速為0.8 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的吸附性能

2.1.1靜態(tài)吸附在溫度25 ℃下，MIPs和 NIPs對(duì)MG的吸附等溫線見圖1a。隨著MG初始濃度的增加，MIPs和NIPs對(duì)MG的吸附容量(Q)隨之增加。相同濃度下，MIPs中由于存在與MG相匹配的印跡孔穴，吸附容量遠(yuǎn)大于NIPs。當(dāng)MG濃度為45 μg/mL時(shí)，吸附達(dá)到飽和，MIPs的最大吸附容量達(dá)到 4.69 mg/g，高于現(xiàn)有方法[9 - 10]。

圖1 靜態(tài)吸附曲線及擬合模型Fig.1 Static adsorption curve and the fitting model a.Static adsorption curve;b.Freundlich model of MIPs;c.Langmuir model of NIPs.

MIPs和NIPs的靜態(tài)吸附數(shù)據(jù)采用Freundlich模型和Langmuir模型擬合，結(jié)果如表1所示。MIPs的Freundlich吸附方程的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9956，與Langmuir方程相比具有更好的線性關(guān)系。因此，MIPs對(duì)MG的吸附更傾向于多分子層吸附，結(jié)合位點(diǎn)是非均一性的，而NIPs符合Langmuir模型，屬于單分子層吸附。

表1 吸附等溫模型參數(shù)

2.1.2動(dòng)態(tài)吸附對(duì)聚合物動(dòng)力學(xué)吸附性能進(jìn)行考察(圖2a)，MIPs在2.5 h達(dá)到吸附平衡，而NIPs在1.5 h達(dá)到吸附平衡。為進(jìn)一步探究其吸附過程，對(duì)吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模型擬合(圖2b)，由表2相關(guān)系數(shù)R2可知，MIPs符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力模型，存在著表面的物理吸附及印跡孔穴的特異性吸附，表面的物理吸附傳質(zhì)阻力小，吸附速率快，屬于快吸附過程，而特異性吸附過程中，模板分子進(jìn)入印跡孔穴時(shí)傳質(zhì)阻力增大，吸附速率慢，屬于慢吸附過程，而NIPs符合動(dòng)力學(xué)準(zhǔn)一級(jí)模型，證明只存在表面物理吸附過程，而無特異性吸附。

圖2 動(dòng)力學(xué)吸附曲線及擬合模型Fig.2 Dynamic adsorption curve and the fitting model a.Kinetic curves;b.Pseudo-first-order of MIPs and NIPs;c.Pseudo-second-order of MIPs and NIPs.表2 準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程和準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合參數(shù)Table 2 Pseudo-first-order and pseudo-second-order parameters

PolymerPseudo-first-ordermodelPseudo-second-ordermodelk1/(h-1)Q1/(mg/g)R2k2/(g/(mg·h)Q2/(mg/g)R2MIPs1.95516.860.92349.095.180.9897NIPs2.8065.7520.99182.921.690.8297

2.2 MISPE固相萃取條件優(yōu)化

2.2.1淋洗溶劑條件優(yōu)化考察乙腈、甲醇、正己烷、氯仿、丙酮作為淋洗溶劑時(shí)，對(duì)洗脫率的影響。結(jié)果顯示，乙腈、甲醇、氯仿、丙酮為淋洗液時(shí)，在MISPE柱中MG檢出量均大于20%，在NISPE柱中MG檢出量均大于60%，說明這些溶劑在除去雜質(zhì)和干擾物的同時(shí)損失大量目標(biāo)化合物，因此不能做為淋洗液。而以正己烷為淋洗劑時(shí)，在MISPE柱上MG檢出量為7.1%，在NISPE柱上MG檢出量為21.2%，原因是正己烷極性弱于其他4種溶劑，對(duì)模板與印跡孔穴之間氫鍵破壞程度最小，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以正己烷為淋洗液。

2.2.2洗脫溶劑條件優(yōu)化參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[11 - 13]，選擇甲醇/乙酸，甲醇/水，乙腈/水作為洗脫溶劑，結(jié)果見圖3。當(dāng)以甲醇/乙酸為洗脫液時(shí)，回收率最大為98.7%，原因是MG 在甲醇中有很好的溶解性，加入乙酸后，乙酸的羧基易與模板分子之間形成氫鍵，從而破壞功能單體與模板之間的作用力，減少M(fèi)G殘留，確保洗脫完全。由圖中還可見，洗脫液體積為4 mL時(shí)，回收率達(dá)到最大且平衡，因此確實(shí)洗脫液體積為4 mL。

2.2.3印跡柱的性能評(píng)價(jià)為考察MISPE柱對(duì)MG選擇性吸附能力，選擇與MG結(jié)構(gòu)類似的隱性孔雀石綠(LMG)、結(jié)晶紫(CV)、隱性結(jié)晶紫(LCV)為對(duì)照物，考察它們?cè)贛ISPE柱和堿性Al2O3柱上的吸附容量，結(jié)果見圖4。MISPE柱對(duì)模板MG吸附容量為4.78 mg/g，高于其它3種結(jié)構(gòu)類似的水產(chǎn)藥物，這說明MISPE柱對(duì)孔雀石綠有良好的特異性吸附能力；Al2O3柱對(duì)4種分析物的吸附容量十分相近，其吸附作用是非特異性的，且對(duì)于MG的吸附容量與MISPE柱有明顯差距。

圖3 洗脫液對(duì)回收率的影響Fig.3 Effect of eluent on the recoveries of MG

圖4 MISPE柱和堿性Al2O3柱對(duì)其結(jié)構(gòu)相似物的吸附容量Fig.4 Adsorption capacity of vanillin and its analogues on MISPE and Al2O3 column

2.3 水產(chǎn)品中孔雀石綠的檢測(cè)

2.3.1線性范圍與檢出限實(shí)驗(yàn)以空白鯽魚基質(zhì)提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)MG儲(chǔ)備溶液，配制濃度為0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、2.5、5.0 μg/mL的MG標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行MISPE-HPLC方法分析，以MG濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，得到的線性關(guān)系為：y=70 324x-1 004.3，R2>0.999，在0.01～5.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。通過對(duì)7種空白樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，以大于3倍信噪比(S/N)作為檢出限，求得檢出限為2.01×10-3μg/mL，以大于10倍信噪比(S/N)作為定量限，計(jì)算得定量限為6.7×10-3μg/mL。

圖5 鯽魚樣品色譜圖Fig.5 Chromatograms of crucian carp samplea.Crucian carp sample without extraction;b.Extration by alkaline Al2O3 column;c.Extration by MISPE column.

2.3.2準(zhǔn)確度與精密度分別在鯽魚，鯰魚，黃花魚，小龍蝦，基圍蝦，扇貝，生蠔7種水產(chǎn)空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加入1.0、1.5、2.0 μg/mL 3個(gè)濃度水平MG溶液，測(cè)定準(zhǔn)確度和精密度。MG加標(biāo)回收率范圍為81.2%～101.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)范圍為1.7%～5.4%，優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)方法[11]。

2.3.3色譜行為分別以 MISPE柱和目前國家標(biāo)準(zhǔn)中常使用的堿性Al2O3柱，對(duì)加標(biāo)的小龍蝦肌肉樣品中的MG進(jìn)行分離富集，結(jié)合HPLC法分析，其色譜圖見圖5。經(jīng) MISPE和堿性Al2O3柱處理后，均有效去除了基質(zhì)干擾，但MISPE柱富集倍數(shù)更高，去除雜質(zhì)效果更好。這是因?yàn)?MISPE柱的印跡填料內(nèi)存在與 MG結(jié)構(gòu)匹配的記憶孔穴，對(duì) MG顯示出高選擇性，這正是分子印跡聚合物的特點(diǎn)所在。

3 結(jié)論

以MG 為模板分子，MAA為功能單體，采用沉淀聚合法，制備了 MG分子印跡固相萃取填料。在MISPE優(yōu)化條件下，應(yīng)用于水產(chǎn)品中 MG檢測(cè)的樣品凈化。結(jié)果表明，MISPE 萃取效果優(yōu)于傳統(tǒng)堿性Al2O3柱，表現(xiàn)出對(duì)MG優(yōu)異的凈化效果和富集能力，為富集水產(chǎn)品中MG殘留，提供了新材料。

參考文獻(xiàn)：

[1] WANG Y,CHEN L G.Journal of Chromatography B，2015,(1002)：98.

[2] NY 5071-2002.The Pollution-Free Food Standards-Fishing with Drug Use(無公害食品-漁用藥物使用準(zhǔn)則).

[3] SU L Q,WANG L B,ZHANG H J,et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(蘇立強(qiáng)，王麗博，張慧潔，等.分析試驗(yàn)室),2017，36(08)：938.

[4] WU L,LIN Z Z,ZHONG H P,et al.Sensors & Amp;Actuators:B Chemical,2017,239:166.

[5] LIN Z Z,ZHANG H Y.Reactive and Functional Polymers，2016,(98)：24.

[6] ZU G Q,ZHAO Q,TAN C,et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(祖廣權(quán)，趙琪，譚策，等.分析試驗(yàn)室)，2017，36(3)：292.

[7] WANG X Y,SUN F Q,ZENG G P,et al.Journal of Analytical Science(王小玉，孫復(fù)錢，曾國屏，等.分析科學(xué)學(xué)報(bào)),2016，32(6)：758.

[8] ZU G Q,SU L Q,ZHAO Q,et al.New Chemical Materials(祖廣權(quán),蘇立強(qiáng),趙琪,等.化工新型材料),2017，45(3):247.

[9] YOU X X,GAO L,QIN D L,et al.Journal of Separation Science，2017，2:227.

[10] ZHANG J Q, LI M，ZHANG S,et al.Chemistry Bulletin(張建清，李明，張思，等.化學(xué)通報(bào)),2016，79(4):366.

[11] XIANG H,TAN L,YUAN S L,et al.Journal of Analytical Science(向輝,譚利,袁絲蘭,等.分析科學(xué)學(xué)報(bào)),2017，33(4)：527.

[12] SC/T 3021-2004.The Determination of Malachite Green Residues in Aquatic Products-Liquid Chromatography(HPLC)(水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的測(cè)定-液相色譜法).

[13] YU F,PAN L S,LIU Y J,et al.Journal of Analytical Science(喻鋒，潘浪勝，劉躍進(jìn)，等.分析科學(xué)學(xué)報(bào)),2017，33(4)：493.