李 騰， 黃桂蘭*, 袁 鈴, 周世坤*

(防化研究院，北京 102205)

核磁共振(NMR)是一種無損分析檢測技術(shù)，1H-NMR可以提供豐富的化合物結(jié)構(gòu)信息，但在實(shí)際應(yīng)用中，若采用1H-NMR技術(shù)檢測，樣品基質(zhì)背景干擾太大，掩蓋目標(biāo)化合物信號(hào)峰，對化合物的鑒定存在干擾；而31P{1H}-NMR技術(shù)可以在復(fù)雜基質(zhì)干擾下，只對含磷化合物產(chǎn)生信號(hào)響應(yīng)[1]，并且其化學(xué)位移譜寬一般為-30～200 ppm，比氫譜化學(xué)位移寬的多，同時(shí)在對氫去偶的條件下，其譜峰信號(hào)為單峰，方便對化合物的指認(rèn)[2 - 3]。奎寧醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺、二異丙胺基乙醇是一類在制藥工業(yè)和化學(xué)毒劑合成中具有廣泛用途的化合物，是禁止化學(xué)武器公約組織(OPCW)實(shí)施核查檢測的目標(biāo)化合物[4]。

Martin等[5]報(bào)道了利用氨基磷酸單酯作為磷?；噭┩ㄟ^SN2機(jī)理反應(yīng)衍生醇形成磷酸二酯。陳茹玉等[6]報(bào)道了磷脂的不對稱合成，其中運(yùn)用了POCl3在水中作為磷?；噭┝柞；?。Avik等[7]利用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)(CTMP)磷?；苌呛谆湎嚓P(guān)化合物，并通過31P{1H}-NMR確認(rèn)。丁貽祥等[8]等報(bào)道了利用二乙基磷酰氯作為磷?；噭┡c苯基丙酮反應(yīng)生成兩個(gè)O-磷?；a(chǎn)物。本文以二苯基次膦酰氯[9]、POCl3[10]、CTMP[11]為磷酰化試劑，以31P{1H}-NMR為檢測手段，研究了奎寧醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺和二異丙胺基乙醇轉(zhuǎn)化為含磷化合物的衍生條件。進(jìn)而通過31P{1H}-NMR間接鑒定這些醇類化合物?？疾炝搜苌a(chǎn)物的穩(wěn)定性、方法檢出限及回收率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian NMR System 600超導(dǎo)核磁共振儀(美國，Varian公司)，600 MHz 5 mm脈沖梯度場雙通道寬帶多核共振探頭，工作站軟件VnmrJ 2.1B和VnmrJ 4.0；移液槍(德國，Eppendorf公司)。

二苯基次膦酰氯(分析純，美國Sigma-Aldrich公司)；POCl3(分析純，美國Sigma-Aldrich公司)；2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)(CTMP)(分析純,美國Sigma-Aldrich公司)；氘代氯仿(CDCl3，99.8%氘代度，含0.03%TMS，CIL公司)；其他試劑均為分析純?？鼘幋肌⒘蚨蚀?、甲基二乙醇胺、三乙醇胺、二異丙胺基乙醇由本院提供。

1.2 磷譜檢測條件

圖1 磷?；苌磻?yīng)式Fig.1 The phosphorylation reactions for alcohol compounds

31P{1H}-NMR檢測條件：31P核共振頻率：242.812 MHz；譜寬sw=59523.8 Hz；射頻功率：tpwr=54 dB；90度脈沖寬度：pw90=9.75 μs；檢測脈沖寬度：pw=3.25 μs；脈沖延遲時(shí)間：d1=0.3 ms；采樣時(shí)間：at=1 ms；氫去偶射頻功率：dpwr=42 dB；去偶方式：dm=’yyy’；接收機(jī)增益：gain=autogain；檢測溫度：25 ℃。

1.3 磷酰化衍生反應(yīng)

磷?；苌磻?yīng)見圖1。醇類化合物溶解于衍生溶劑，取0.5 mL轉(zhuǎn)移入核磁管中，先后加入10 μL等體積的吡啶和磷?；噭?，搖勻，室溫或水浴加熱反應(yīng)，進(jìn)行31P{1H}-NMR檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷?；噭┑倪x擇

實(shí)驗(yàn)以二異丙胺基乙醇作為醇類化合物的代表，以CDCl3為衍生溶劑，考察三種磷酰化試劑衍生效果。取0.5 mL×1 μmol/mL 二異丙胺基乙醇/CDCl3溶液于核磁管中，加5 μL磷?；噭┓磻?yīng)1 h；同時(shí)取0.5 mL CDCl3、5 μL磷酰化試劑混合作為空白對照樣品進(jìn)行31P{1H}-NMR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，磷酰化試劑CTMP與二苯基次膦酰氯的衍生效果最好，可以明確分辨出衍生產(chǎn)物峰，而三氯氧磷過于活潑，在反應(yīng)5 min監(jiān)測就有四個(gè)產(chǎn)物峰，無法具體指認(rèn)三氯氧磷與二異丙胺基乙醇的反應(yīng)產(chǎn)物。綜上考慮，磷?；噭┻x用CTMP與二苯基次膦酰氯。

2.2 磷?；苌a(chǎn)物磷譜化學(xué)位移的確定

將醇類化合物溶解于CDCl3后，取0.5 mL于核磁管中，加入5 μL磷酰化試劑，搖勻，室溫下放置1 h，同時(shí)取0.5 mL CDCl3、5 μL磷?；噭┗旌献鳛榭瞻讓φ諛悠愤M(jìn)行31P{1H}-NMR檢測。結(jié)果如表1所示。

表1 醇類化合物磷酰化衍生產(chǎn)物31P{1H}-NMR化學(xué)位移

2.3 衍生條件的選擇優(yōu)化

2.3.1衍生溶劑的選擇磷?；噭λ容^敏感，因此衍生反應(yīng)需在非質(zhì)子化溶劑中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)考察了以CH2Cl2、CDCl3和DMF作為衍生溶劑。取0.5 mL×1 μmol/mL 奎寧醇/衍生溶劑溶液于核磁管中，加5 μL磷?；噭┦覝胤磻?yīng)1 h；0.5 mL 衍生溶劑、5 μL磷?；噭┗旌献鳛榭瞻讓φ諛悠愤M(jìn)行檢測，以產(chǎn)物峰信噪比作為監(jiān)測指標(biāo)。結(jié)果奎寧醇在CH2Cl2、CDCl3與DMF與CTMP反應(yīng)并無大的區(qū)別，信噪比依次為33、39、34；而奎寧醇在CH2Cl2與CDCl3中與二苯基次膦酰氯的反應(yīng)沒有衍生產(chǎn)物生成。以DMF為溶劑時(shí)，奎寧醇與二苯基次膦酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物信噪比為8，有少量目標(biāo)產(chǎn)物生成，可能原因?yàn)榭鼘幋寂c二苯基次膦酰氯反應(yīng)因存在空間位阻，反應(yīng)較困難，當(dāng)使用DMF做溶劑，可以起到縛酸劑的作用，促使反應(yīng)正向進(jìn)行，因此衍生溶劑選擇DMF。

2.3.2吡啶對衍生反應(yīng)的影響以0.5 mL×10 μmol/mL 甲基二乙醇胺/DMF溶液與10 μL二苯基次膦酰氯為研究對象，考察縛酸劑吡啶對衍生反應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加縛酸劑可以明顯提高反應(yīng)速率，因此該衍生反應(yīng)選擇加10 μL吡啶作為縛酸劑。

圖2 不同時(shí)間CTMP對醇類化合物的衍生效率Fig.2 The derivatization efficiency at different time using the derivatization reagent CTMP

圖3 不同時(shí)間二苯基次膦酰氯對醇類化合物衍生效率Fig.3 The derivatization efficiency at different time using the derivatization reagent diphenyl phosphinyl chloride

2.3.3時(shí)間對衍生結(jié)果的影響選擇以多元醇全部羥基與磷?；噭┭苌漠a(chǎn)物作為監(jiān)測對象。取0.5 mL×10 μmol/mL醇類化合物/DMF溶液于核磁管中，加過量磷酰化試劑反應(yīng)，考察時(shí)間對衍生結(jié)果的影響，如圖2、圖3所示。使用CTMP作為衍生試劑時(shí)，其反應(yīng)活性特別高，但衍生產(chǎn)物隨著時(shí)間的增長在減少，說明由CTMP作為衍生試劑衍生醇類化合物產(chǎn)物穩(wěn)定性不是很好；并且發(fā)現(xiàn)衍生產(chǎn)物最終降解的產(chǎn)物大約在16.54 ppm，而CTMP與水反應(yīng)的產(chǎn)物也是16.54 ppm，說明水解是導(dǎo)致衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定的原因。由二苯基次膦酰氯作為磷酰化試劑衍生醇類化合物，其反應(yīng)活性雖沒有CTMP反應(yīng)活性高，但隨著時(shí)間的推移，衍生產(chǎn)物量逐漸增多，且最后衍生產(chǎn)物穩(wěn)定；而利用二苯基次膦酰氯衍生奎寧醇在常溫下反應(yīng)量極少，無法積分檢測，因此在50 ℃水浴條件下加熱1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其衍生產(chǎn)物明顯增多，采用歸一化積分方法，其衍生效率約為89%。

2.3.4溫度對衍生結(jié)果的影響考慮到常溫下CTMP對醇類化合物的衍生結(jié)果不穩(wěn)定，因此不考察溫度對CTMP衍生醇類化合物結(jié)果的影響。以0.5 mL×1 μmol/mL甲基二乙醇胺為研究對象，二苯基次膦酰氯為磷?；噭疾炝瞬煌瑴囟?25 ℃、50 ℃和75 ℃)對衍生結(jié)果的影響。加熱可以促進(jìn)反應(yīng)速率，但使用50 ℃與75 ℃作為反應(yīng)溫度差別并不是很大，因此選擇反應(yīng)溫度為50 ℃，反應(yīng)時(shí)間為1 h。

2.4 衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)考察了CTMP衍生0.5 mL×1 μmol/mL醇類化合物的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示反應(yīng)5 min，5種化合物的CTMP衍生產(chǎn)物信噪比基本大于3，但隨著時(shí)間的推移，信噪比依次降低，到30 min后就檢測不到了,即CTMP衍生醇類化合物的產(chǎn)物不穩(wěn)定。利用二苯基次膦酰氯對1 μmol/mL的醇類化合物衍生，衍生溫度采用50 ℃，衍生時(shí)間1 h，10 μL吡啶作為縛酸劑，考察了其日間穩(wěn)定性，結(jié)果表明，由二苯基次磷酰氯衍生醇類化合物產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 衍生方法的檢出限

在31P{1H}-NMR檢測條件下，以二苯基次膦酰氯為衍生試劑，DMF為衍生溶劑，奎寧醇、硫二甘醇、甲基二乙醇胺、三乙醇胺、二異丙胺基乙醇的檢出限，考察結(jié)果依次為9、7、6、6、10 μg/mL。

2.6 水樣基質(zhì)中方法的應(yīng)用

以二異丙胺基乙醇為醇類代表，取0.5 mL×50 μmol/mL和5 μmol/mL水溶液，用1 mol/L的HCl調(diào)pH值為1，旋蒸至干，用0.5 mL DMF復(fù)溶，加20 μL吡啶以除去酸，加40 μL二苯基次磷酰氯以保證衍生化試劑過量，50 ℃水浴加熱反應(yīng)1 h，31P{1H}-NMR檢測。歸一化法得到兩種濃度下回收率依次為69%和53%。

3 結(jié)論

采用二苯基次膦酰氯為衍生試劑，DMF為溶劑，在核磁管內(nèi)原位衍生醇類化合物測定磷譜的分析方法，為解決復(fù)雜背景下非磷化學(xué)毒劑前體的1H譜無法滿足鑒定要求的問題，提供了一種簡便的解決途徑。所建立方法具有反應(yīng)專一、產(chǎn)物穩(wěn)定、方法簡便的特點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Messilakso M.Chemical Weapons Convention Chemicals Analysis,Sample Collection,Preparation and Analytical Methods.Chichester:John Wiley & Sons Ltd：2005，322.

[2] YE R H.Study and Application of NMR Spectra of Phosphorus-containing Compounds.Guangzhou:Guangdong University of Technology(葉汝漢.含磷化合物的核磁共振譜圖研究與應(yīng)用.廣州:廣東工業(yè)大學(xué)),2011.

[3] MA R.Characteriaztion of Phosphorus Forms in Environmental Materials and their Transformation in Soils by31Phosphorus Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy.Nanjing:Nanjing Agricultural University(馬瑞.利用31P-NMR技術(shù)研究環(huán)境樣品中磷形態(tài)特征及其在土壤中形態(tài)轉(zhuǎn)換.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)),2009.

[4] Convention on the Prohibition of the Development,Production,Stockpiling and Use of Chemical Weapons and their Destruction(1997) Technical Secretariat of the Organization for Prohibition of Chemical Weapons.The Hague,The Netherlands.http://www.opcw.org.

[5] Martin J P.Chem Commun,2004,1952.

[6] CHEN R Y,ZHOU J.Organic Chemistry (陳茹玉，周嘉.有機(jī)化學(xué)),1997,(17):193.

[7] Avik M,Ajeet K,Ajay K,et al.Anal Bioanal Chem,2012,402:1643.

[8] DING Y X,YUAN C Y,Chemistry Bulletin(丁貽祥，袁承業(yè).化學(xué)通報(bào)),1987,45：785.

[9] Naoyoshi M,Akemi F,Yuki H,et al.Tetrahedron,2002,58:3493.

[10] YUAN C Y,LONG H Y,SHEN D Z,et al.Scientia Sinica(袁承業(yè)，龍海燕，沈定璋，等.中國科學(xué)),1984,12：1088.

[11] HUANG G L,YUAN L,LIU S L,et al.Chin J Anal Chem(黃桂蘭，袁鈴，劉石磊，等.分析化學(xué))2015,43(12)：1927.