夏 青， 陸美林， 張曉麗， 章俊平， 于源華,， 何秀霞*,

(1.長春理工大學生命科學技術學院，吉林長春 130022，2.長春理工大學環(huán)境與工程學院，吉林長春 130022)

目前，結構納米材料在生物醫(yī)學領域引起了廣泛關注，包括超靈敏探測、生物醫(yī)學成像、靶向治療等[1]。尤其是在分子成像領域，如核磁共振成像(MRI)[2 - 3]、正電子發(fā)射斷層成像(PET)[3]、電子計算機X射線斷層掃描(CT)[4 - 5]、單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)[6 - 7]、光學成像[8]等進行腫瘤體內外成像診斷。為了提高疾病診斷的準確度，理想的方法是將多種成像模式集于一種納米材料中。

Fe2O3@Au納米粒子中的Fe2O3具有超順磁性，可在MRI中作為T2測量的造影劑[9 - 10]。而Au納米粒子作為一種新的CT造影劑可用于腫瘤成像[11]，其與傳統(tǒng)的含碘造影劑相比有更高的X射線吸收系數(shù)、易于表面修飾、良好的生物兼容性和較長的循環(huán)時間，可以在較長時間內進行成像。已有研究小組制備了Fe2O3@Au應用于生物系統(tǒng)的雙模態(tài)MRI/CT成像[12 - 13]。但是納米粒子的粒徑、形狀、表面活性等影響了它在生物體中的應用[14 - 15]。20～50 nm 粒徑大小的納米粒子表現(xiàn)出最有效的吸收動力學特性，這可能是細胞吸收納米粒子最有效的尺寸，同時球形納米粒子要比其它形狀的納米粒子更易被吸收[16 - 17]。本文制備了26 nm球形Fe2O3@Au納米粒子，具有低毒、高X射線吸收系數(shù)、高流通性和穩(wěn)定性。通過荷瘤裸鼠的活體成像實驗，證明了小粒徑的Fe2O3@Au具有更強的體內成像能力。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

3.0T超導型磁共振掃描儀 (Signa HDx)，5.0 cm 小動物實驗專用線圈，GE64排螺旋CT系統(tǒng)均為美國GE公司；Urmini-1240紫外-可見分光光度計(日本，島津公司)；H-600型透射電子顯微鏡(TEM)(日本，日立公司)；JSM6490LA能譜儀(EDS)(日本，電子公司)。

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO)等，購自北京鼎國生物有限公司。其它化學試劑均為分析純。所有實驗用水均為Milli-Q超純水(18.2 MΩ·cm)。

細胞培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司。SW620人結直腸癌細胞株購自中科院上海細胞庫。BALB/c裸鼠(雄性，4～5周齡，20 g左右)購自中科院上海實驗動物中心，飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境(吉林大學實驗動物中心)，使用裸鼠專用飼料和無菌水飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1Fe2O3@Au核殼納米粒子的合成改進Lyon等人所報道的方法[18]，通過共沉淀法制備Fe3O4納米粒子[19]。將100 mL 0.01 mol/L HCl加入Fe3O4納米粒子溶液中，得到的膠體用磁鐵收集并用水沖洗兩次。新制備的Fe3O4納米粒子用0.01 mol/L HNO3溶解，在90～100 ℃水浴中劇烈攪拌6～8 h，直至完全形成Fe2O3后，冷卻至室溫并用水沖洗兩次，用0.1 mol/L的TMAOH沖洗一次。所獲得的Fe2O3納米粒子分散在0.1 mol/L的TMAOH中，靜置直至液體澄清為酒紅色。將Fe2O3膠體用30 mL水稀釋到1.1 mmol/L，加入1.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉，劇烈攪拌10 min后，參考Lyon等人的方法將一定量的0.2 mol/L鹽酸羥胺和1%HAuCl4，間隔10 min先后添加到上述溶液中，直至獲得所需Fe2O3@Au納米粒子。

1.2.2Fe2O3@Au納米粒子的表征及PEG-SH5000的修飾使用紫外-可見分光光度計對Fe2O3@Au納米粒子制備過程進行監(jiān)控。將Fe2O3@Au納米粒子利用能譜儀(EDS)進行元素組成分析。利用透射電子顯微鏡(TEM)在100 kV加速電壓下測量納米粒子粒徑、形貌變化及粒子的分散情況。并由Image J軟件統(tǒng)計200個納米粒子的粒徑。將Fe2O3@Au納米粒子分別與PEG -SH5000 以不同摩爾比(1∶2 500，1∶5 000，1∶10 000，1∶25 000，1∶50 000 和1∶80 000)反應1 h，通過離心除去未反應配體(4 000 r/min，30 min，3次)，分散于水中，4 ℃下保存?zhèn)溆茫麨镻EG -Fe2O3@Au。將其分別分散在不同的緩沖體系中：水、0.4 mmol/L檸檬酸鈉、200 mmol/L NaCl、10 mmol/L HEPES、10 mmol/L PBS、10 mmol/L PBS +10%FBS、100%FBS、DMEM+10%FBS。37 ℃放置7 d，肉眼觀察并進行紫外-可見光譜的測量。考察PEG -Fe2O3@Au在各種緩沖液中的穩(wěn)定性。

1.2.3細胞毒性實驗以1.0×104cells/mL的密度將 SW620細胞接種于96-孔板中，過夜孵育細胞后，更換含有不同濃度PEG -Fe2O3@Au(0.06、0.12、0.24、0.48、0.72 nmol/L)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h之后去掉含納米粒子的培養(yǎng)基，在新鮮培養(yǎng)基中添加10 μL MTT(5 mg/mL)[20]。先用酶標儀的全波長掃描測出吸收峰，將該吸收峰所在的波長作為測量波長。用微型孔板分光光度計讀出510 nm處的吸光度值，以未與Fe2O3@Au共培養(yǎng)的SW620細胞為對照組。相對的細胞活率為[A]test/[A]control×100%。每組實驗重復3次。

1.2.4試管的MRI/CT成像將不同F(xiàn)e濃度(0.06、0.12、0.18、0.24、0.36、0.48、0.6、0.72 mmol/L)的Fe2O3@Au及PEG -Fe2O3@Au的PBS溶液各1 mL，分別置于1.5 mL離心管中，用MFSE序列進行T2馳豫時間的測量。參數(shù)如下：TR=2 500,TE=13～104 ms,flip angle=90°,resolution=256×256,section thickness=3 mm,FOV=16×16 mm。T2馳豫效率由1/T2與納米粒子的Fe濃度的函數(shù)關系得到的線性關系的斜率決定。T2mapping是由3.0 T超導型磁共振掃描儀執(zhí)行完成。不同Au濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.5 mg/mL)CT成像是由64排CT成像系統(tǒng)完成。成像參數(shù)如下：100 kV，80 mA，silce thickness=0.625 mm。測定每個樣品的Hounsfield units(HU)值。

1.2.5荷瘤裸鼠模型的建立及體內的MRI/CT成像將結直腸癌細胞SW620以1.0×107cells/mL用DMEM培養(yǎng)基重懸，以200 μL/只用量對4～6周齡的BALB/c裸鼠(約20 g)進行右腋皮下接種，接種2周后待腫瘤直徑達到3～5 mm左右進行成像分析。先將0.25 mL(52 nmol/L Fe2O3@Au，其中Au和Fe分別為 5.93、1.7 mg/mL)的Fe2O3@Au的PBS溶液經(jīng)裸鼠的腫瘤區(qū)域皮下注射到體內，分別在注射前和注射30 min后進行CT和T2 MRI成像分析。CT成像參數(shù)同前，MRI參數(shù)如下：TR：4 000 ms，TE：17.5 ms，F(xiàn)OV：12.0×12.0，DFOV：8.0 cm，288×256，1.0 mm。以同樣直徑的目標區(qū)域(the region of interest(ROI))放置在注射及未注射造影劑T2-成像的同一片層，得到腫瘤的信號強度。

2 結果與討論

2.1 納米粒子的表征

合成過程中所獲得的Fe2O3納米粒子分散在0.1 mol/L TMAOH中，必須靜置直至液體澄清為酒紅色才可以使用，經(jīng)過靜置會獲得平均粒徑3.90±1.39 nm均勻的納米粒子膠體溶液，伴隨鹽酸羥胺和1%HAuCl4的加入，溶液顏色由淡黃色逐漸變成類似純金納米粒子的深紅色(圖1插圖)。要比Lyon在最終合成的呈深粉紅色Fe2O3@Au納米粒子溶液更接近純Au納米粒子的顏色，表明納米粒子粒徑更小而且表面包被了更多的Au，便于后續(xù)利用Au的特性進行CT成像。如圖1所示，SPR峰值逐漸增加并藍移至521 nm。說明Au在納米粒子中的量增加。EDS譜圖表明了Fe和Au同時存在(圖2)。由電感耦合等離子體發(fā)射光譜定量分析可知Au∶Fe2O3的摩爾比約為1.07∶1。

圖1 Fe2O3@Au納米粒子的紫外-可見(UV-Vis)光譜圖(插圖為合成納米粒子溶液顏色的變化)Fig.1 UV-Vis spectra of Fe2O3@Au nanoparticles(The inset shows a color change of the nanoparticle dispersiov solution)

圖2 Fe2O3@Au納米粒子的能譜(EDS)圖Fig.2 EDS spectra of Fe2O3@Au nanoparticles

由透射電鏡(TEM)表征結果可知：Fe2O3的平均粒徑是3.90±1.39 nm (圖3A)，F(xiàn)e2O3@Au的平均粒徑值變?yōu)?6.22±4.14 nm(圖3B)，且證實了納米粒子近似球狀并具有較窄的粒徑分布。

圖3 Fe2O3(A)和Fe2O3@Au(B)納米粒子的透射電鏡(TEM)圖(插圖表示納米粒子的粒徑分布柱狀圖)Fig.3 TEM images of Fe2O3(A) and Fe2O3@Au(B)(The inset shows the histogram of the size distribution the nanoparticles)

觀察PEG -Fe2O3@Au納米粒子在各種介質中，于37 ℃下放置7 d之后沒有明顯的沉淀，在水中和0.4 mmol/L 檸檬酸鈉中的紫外-可見光譜幾乎沒有發(fā)生變化。在其它緩沖溶液中隨著時間的延長，納米粒子在離心管管壁上發(fā)生吸附使紫外-可見光譜的吸收峰下降。但納米粒子的SPR峰值未發(fā)生明顯移動，說明其未發(fā)生變性。表明PEG -Fe2O3@Au在各種生理環(huán)境條件下具有更好的膠體穩(wěn)定性。

2.2 細胞毒性試驗

以510 nm為測量波長，用微型孔板分光光度計讀出510 nm處的吸光度值。MTT分析SW620與高達0.7 nmol/L PEG -Fe2O3@Au納米粒子作用24 h之后，發(fā)現(xiàn)隨著納米粒子濃度的增加，相對細胞活率反而高于對照組，類似于Xie和Chien等人的研究結果[21 - 22]。表明PEG -Fe2O3@Au不影響細胞新陳代謝且有很好的生物兼容性(圖4)。

圖4 MTT檢測PEG -Fe2O3@Au 納米粒子與細胞作用24小時后的細胞毒性Fig.4 The cell survival rate of SW620 human colorectal cancer cells after mixed with different concentrations of PEG -Fe2O3@Au for 24 h by MTT assay.

2.3 試管的MRI/CT成像

通過3.0 T核磁成像儀對不同濃度Fe2O3@Au納米粒子溶液T2值進行測量，結果表明Fe2O3@Au納米粒子的馳豫效率為83.75 L/(mmol·s)，而PEG -SH修飾的Fe2O3@Au納米粒子的馳豫效率則減少到56.12 L/(mmol·s)，這是由于納米粒子表面PEG -SH層屏蔽了水分子與納米粒子表面的接近，從而引起了r2馳豫效率的降低(圖5)。圖6插圖為不同濃度納米粒子的T2核磁成像，PBS為對照，隨著Fe濃度的增加，成像信號明顯變暗。

同樣CT成像證實Fe2O3@Au納米粒子的X射線吸收強度隨著納米粒子濃度的增加而增加。當納米粒子中的Au濃度為4.2 mg/mL 的Hounsfield Unit值為200 HU，等同于目前臨床通用的基于碘的小分子的CT造影劑8 mg/mL Omnipaque的造影效果，X射線吸收系數(shù)是碘的1.93倍(比碘高93%)，高于張松等人[23]的1.87倍，顯示了其更優(yōu)越的成像性能(圖6)。

圖5 PEG -Fe2O3@Au和Fe2O3@Au的T2馳豫效率(1/T2)(插圖為PEG -Fe2O3@Au和Fe2O3@Au納米粒子的T2-wMR成像)Fig.5 T2 relaxed efficiency(1/T2) of PEG -Fe2O3@Au and Fe2O3@Au nanoparticles(The inset shows T2-wMR images of PEG -Fe2O3@Au and Fe2O3@Au nanoparticles)

圖6 在100 kVp條件下不同濃度PEG -Fe2O3@Au 納米粒子的HU值(插圖為相應的CT成像)Fig.6 HU values of various concentrations of PEG-Fe2O3@Au nanoparticles at 100 kVp(The inset shows CT images of PEG -Fe2O3@Au nanoparticles)

2.4 納米粒子體內成像分析

將溶于250 μL NaCl 溶液的52 nmol/L Fe2O3@Au納米粒子，皮下注射到裸鼠腋下腫瘤部位(用紅色圈標出)。發(fā)現(xiàn)納米粒子注射后30 min仍然保留。CT測量的HU值從40(圖7a)增加到700(圖7b)。MRI成像中，腫瘤區(qū)域在注射納米粒子前值為1 015(圖7(c))，而注射納米粒子30 min后值為1 904(圖7(d))，腫瘤區(qū)域明顯變暗。

圖7 對荷瘤裸鼠進行CT(a和b)成像和T2 MRI(c和d)成像及未注射(a和c)和注射Fe2O3@Au納米粒子30 min后(b和d)的成像Fig.7 CT(a and b)and T2 MRI(c and d)images of the nude mice bearing a tumor pre-injection without intratumoral injection of Fe2O3@Au nanoparticles(a and c) and with intratumoral injection of Fe2O3@Au nanoparticles after 30 min

3 結論

本文結合Fe3O4的超順磁性及Au納米粒子的X射線吸收特性，制備了小粒徑且具有良好生物相容性的Fe2O3@Au納米粒子，實現(xiàn)了荷瘤裸鼠的活體MRI/CT雙模態(tài)成像，并有望將Fe2O3@Au進一步作為靶向探針應用于活體雙模態(tài)成像。

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