盧勁曄，趙懷寶，顧蓓蓓，馮 晴，張 磊，許 君，沈贊明

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；3.連云港東?？h動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 連云港 222300）

反芻動(dòng)物的胃是復(fù)胃，由四個(gè)胃室組成，分別是瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃。其中，瓣胃為第三個(gè)胃室，主要起“篩網(wǎng)作用”，進(jìn)入瓣胃的大顆粒食物在瓣胃肌肉的收縮下被研磨成細(xì)小的顆粒。瓣胃是反芻動(dòng)物特有的、主要的消化和吸收器官之一。研究發(fā)現(xiàn)，提高精料飼喂比率后，瘤胃重量提高，而瓣胃重量下降[1]。前期的研究主要集中在提高精料比率后對(duì)瘤胃上皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，而對(duì)瓣胃重量的下降并未進(jìn)行深入探索，而目前與此相關(guān)的報(bào)道也很少，并且主要集中在表觀指標(biāo)的測(cè)定，對(duì)其機(jī)理并未進(jìn)行闡述和分析。本試驗(yàn)擬進(jìn)一步研究不同精粗比日糧對(duì)瓣胃上皮生長(zhǎng)的影響及其機(jī)理。

1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)

試驗(yàn)動(dòng)物選用健康青年波雜山羊24只（90～120日齡）。試驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)2周時(shí)間，期間對(duì)山羊進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)，山羊自由采食及飲水，逐漸增加精料飼喂量至400 g·d-1。試驗(yàn)開(kāi)始后，根據(jù)體重相近及公母對(duì)半原則，隨機(jī)分為純粗料（PS組，n=8）、粗料加低精料（PSLC組，n=8）和粗料加高精料組（PSHC組，n=8）。試驗(yàn)期間自由飲水及采食花生桿；PSLC組飼喂精料200 g·d-1，PSHC組飼喂精料400 g·d-1，飼喂持續(xù)42 d，第43 d屠宰取樣，飼糧營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧營(yíng)養(yǎng)水平 DM

1.2 樣品采集

山羊屠宰后取瓣胃，去除內(nèi)容物并清洗后稱重，并剪取適量瓣胃葉片，用預(yù)冷的PBS（pH7.4）反復(fù)沖洗，再用吸水紙擦干，部分樣品用10%福爾馬林溶液固定，部分樣品置于液氮保存。

1.3 血清EGF濃度測(cè)定

無(wú)菌采血，ELISA試劑盒測(cè)定血清EGF濃度，EGF ELISA Kit購(gòu)自R&D Systems公司。

1.4 瓣胃上皮細(xì)胞培養(yǎng)

采取新鮮瓣胃葉片，刷洗干凈，剪取約0.5 g組織，用加入4倍雙抗D-Hanks液漂洗3次，用胰酶水浴消化20 min后棄去上清液，重復(fù)3次。再將剩余組織放入無(wú)菌燒杯中，4倍雙抗D-Hanks液漂洗3次后，繼續(xù)采用胰酶消化，每10 min收集1次消化液。收集的消化液用小牛血清終止消化，并離心得到細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀加入DMEM培養(yǎng)液混勻，調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)·mL-1，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

細(xì)胞貼壁后分為3組，每組6孔重復(fù)。試驗(yàn)組：培養(yǎng)細(xì)胞孔中加入終濃度30和60 ng·mL-1的EGF；對(duì)照組：加入等量的DMEM培養(yǎng)液。8 h后收集細(xì)胞，PBS（pH7.4）洗滌3次后用75%酒精固定。

1.5 流式細(xì)胞分析

將75%酒精固定的上皮細(xì)胞1 500 r·min-1離心10 min。細(xì)胞沉淀用50 μL PBS重懸，再加入500 μL碘化丙啶染液，震蕩混勻后置于室溫避光染色20 min，再用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)10 000～12 000個(gè)細(xì)胞，用ModFit軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比率日糧對(duì)血清EGF濃度的影響

不同精粗比日糧對(duì)山羊血清EGF濃度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同精粗比日糧對(duì)山羊血清EGF濃度的影響

由圖1可知，喂食后3 h，山羊血清EGF濃度均顯著提高（P＜0.05）；與PSHC組相比，PS組喂食后3 h山羊的血清EGF濃度較高。

2.2 不同精粗比率日糧對(duì)瓣胃重量的影響

不同精粗比日糧對(duì)山羊瓣胃重量的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，PS組瓣胃干重顯著高于PSHC組（P＜0.05）。

2.3 EGF對(duì)瓣胃上皮細(xì)胞增殖的影響

流式細(xì)胞儀分析EGF對(duì)瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響見(jiàn)圖3、表3。

由表3可知，EGF處理后顯著提高S期和G2/M期細(xì)胞比率，降低G0和G1期細(xì)胞比率。

圖2 不同精/粗比日糧對(duì)山羊瓣胃重量的影響

圖3 流式細(xì)胞儀分析EGF對(duì)瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響

表3 EGF對(duì)瓣胃上皮細(xì)胞周期的影響 %

3 討論

粗料包括牧草、干草和秸稈等，是反芻動(dòng)物前胃生長(zhǎng)發(fā)育的重要養(yǎng)分。研究表明，提高粗料的攝食比率增大山羊瓣胃干重。結(jié)果與前人研究一致[3-7]。EGF作為多種細(xì)胞分裂促進(jìn)劑，可促進(jìn)多種細(xì)胞增殖。研究表明，粗料提高瓣胃干重的同時(shí)伴隨著血清EGF濃度的升高，提示瓣胃的增重可能與EGF有關(guān)。

細(xì)胞周期指細(xì)胞從1次分裂完成開(kāi)始到下1次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程[5]。細(xì)胞周期可分為G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G（2DNA合成后期）和M（有絲分裂期）4個(gè)期。當(dāng)G1期的細(xì)胞停止分裂，則處于靜息狀態(tài)，此期稱之為G0期。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，表明EGF可提高瓣胃上皮細(xì)胞S期和G2/M期比率，降低G0/G1期細(xì)胞比率，從而加速瓣胃上皮細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

研究結(jié)果表明，高粗料比率日糧可提高山羊血清EGF濃度，進(jìn)而促進(jìn)瓣胃上皮細(xì)胞增殖，加速瓣胃上皮生長(zhǎng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Lu J,Zhao H,Xu J,et al.Elevated cyclin D1 expression is gov?erned by plasma IGF-1 through Ras/Raf/MEK/ERK pathway in rumen epithelium of goats supplying a high metabolizable energy diet[J].J Anim Physiol Anim Nutr,2013,97（6）:1 170-1 178.

[2] Johnson L R,Chandler A M.RNA and DNA of gastric and duode?nal mucosa in antrectomized and gastrin-treated rats[J].Ameri?can Journal of Physiology,1973,224（4）:937-940.

[3] Fluharty F L,Mcclure K E.Effects of dietary energy intake and protein concentration on performance and visceral organ mass in lambs[J].Journal of Animal Science,1997,75（3）:604-610.

[4] Mcclure K E,Solomon M B,Loerch S C.Body weight and tissue gain in lambs fed an all-concentrate diet and implanted with tren?bolone acetate or grazed on alfalfa[J].Journal of Animal Science,2000,78（5）:1 117-1 124.

[5] Norbury C,Nurse P.Animal cell cycles and their control[J].Annu?al Review of Biochemistry,1992,61（1）:441-470.

[6] 郭奇.不同精/粗比日糧對(duì)山羊前胃上皮生長(zhǎng)的影響[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[7] 趙懷寶.日糧粗/精比對(duì)山羊瓣胃上皮生長(zhǎng)的影響及機(jī)理研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.